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瀏覽器自帶分享功能也很好用哦~核糖體印跡測序又稱Ribosome profiling，或Ribo-seq，是運用測序手段研究翻譯組學的一種主要的技術手段。該技術通過使用翻譯抑制劑使正在翻譯的mRNA序列固定在核糖體上。加入核酸酶處理不受核糖體保護的mRNA，分離核糖體并提取純化核糖體上未被消化的短片段mRNA（大約30nt），進而獲得正在翻譯的mRNA序列。這項技術可獲得實時全轉錄組正在翻譯的序列信息，使研究者能從分子水平檢測蛋白組的翻譯情況，并了解蛋白質的翻譯水平及翻譯過程，在蛋白翻譯機制的研究領域中有廣闊的應用前景。
實驗流程圖
樣本要求：
樣品類型：
動物組織、植物組織、細胞、菌類以及客戶分離的RPF（核糖體復合物），其它類型樣品請詳詢。
樣品量：
a) 細胞：4×107
b) 細菌：4×107
c) 動物組織：≥ 400mg
d) 植物組織：≥ 400mg
e) 其它類型樣品用量請詳詢。
樣品的運輸與保存：
在簡單處理并標記后，液氮速凍，-80℃冰箱保存，以避免實驗操作前樣品降解的可能性。干冰運輸。
數據分析（僅供展示，詳見demo報告）
1、基因的識別和注釋
2、差異基因的篩選
使用edgeR或DESeq2對原始count進行標準化并計算兩組樣品間的倍數變化（fold chang）。如下表：
差異表達mRNA（例子）
3、差異基因 GO功能富集分析
4、差異基因KEGG通路分析
5、聚類圖
聚類圖可以用于衡量樣本或基因之間表達的相似性，通常來講，同組的樣品能夠聚在一個分支中。
差異表達基因聚類（例子）
6、散點圖
散點圖（例子）
7、火山圖
當兩組樣品比較時，利用倍數變化和P-value繪制火山圖，火山圖可以反映總體基因的表達情況。
注：兩個樣品比較不畫火山圖
火山圖（例子）
8、P-site
翻譯過程中，核糖體相對于RNA以密碼子長度（3 nt）為單位移動。因此，以 P位點為基準，來源于正常翻譯過程的 RPF 片段應該在 RNA 上呈現 3堿基的周期性分布。
P-site圖（例子）
9、差異TE基因篩選（同時進行mRNA-seq提供以下部分）
翻譯效率的改變是基因翻譯水平調控的主要形式，直接影響蛋白質的產量。翻譯效率（TE）：TE代表樣本中某個基因正在翻譯的mRNA的數量占總mRNA的比例，計算公式為：TE＝Norm data in Ribo-seq / Norm data in RNA-seq。
計算兩組樣品間的所有差異TE基因。以倍數變化（fold chang）>=2篩選差異TE基因。如下表：
10、差異TE基因散點圖
散點圖可直觀展示每個分組比較的差異TE基因分布情況。
散點圖（例子）
11、差異TE基因 GO功能富集分析
12、差異TE基因KEGG通路分析
案例分析
案例1：特異性tRNAs的表達調控驅動基因表達和癌癥進展
原文：Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression
期刊： Cell (2016) 影響因子：36.216
作者通過在5種細胞系中進行tRNA測序研究和Ribo-seq研究發現，在人類乳腺癌中特異性tRNAs：tRNAGluUUC 和tRNAArgCCG表達上調，可使癌細胞獲得轉移能力。研究者通過Ribo-seq檢測這些特殊tRNAs增多后轉錄本上的核糖體結合情況，結果顯示富集這些tRNA同源密碼子的轉錄本更加穩定，核糖體結合更多。特別是tRNAGluUUC通過直接增強EXOSC2表達與增強GRIPAP1來構成一條受tRNA驅使的“可誘導”通路，從而促進癌癥轉移。 因此，該研究說明tRNA是基因表達的動態調節因子，RNA調節是細胞實現特定轉錄物和蛋白質表達改變的一種機制。
案例2：人心臟的翻譯組學研究
原文： The Translational Landscape of the Human Heart
發表期刊： Cell (2019) 影響因子：36.216
基因在人體組織中的表達的研究主要集中在轉錄水平上，而翻譯調控常被忽視。本研究對65例擴張性心肌?。―CM）患者左心室心肌組織和15例正常對照組的左心室心肌組織進行mRNA測序（mRNA-seq）和核糖體印跡測序（Ribo-seq），分析了DCM與健康對照組中RNA分子翻譯效率的總體情況，結合先前研究的心臟組織蛋白質組學的數據，系統分析了左心室心肌組織中被翻譯的ORF以及對應的蛋白或多肽的總體信息。分析后發現在1090個uORF、 22335個傳統的ORF還包括了來自于169個lncRNA 的339個sORF。本文通過分析Ribo-seq數據鑒定出了169個lncRNA和40種環狀RNA (circRNAs)編碼的新的微蛋白，這表明這些微蛋白在人體中的生物學功能尚未被發現。而本研究中的這一發現可能為研究其他人類組織翻譯組學提供依據。
核糖體印跡測序又稱Ribosome profiling，或Ribo-seq，是運用測序手段研究翻譯組學的一種主要的技術手段。該技術通過使用翻譯抑制劑使正在翻譯的mRNA序列固定在核糖體上。加入核酸酶處理不受核糖體保護的mRNA，分離核糖體并提取純化核糖體上未被消化的短片段mRNA（大約30nt），進而獲得正在翻譯的mRNA序列。這項技術可獲得實時全轉錄組正在翻譯的序列信息，使研究者能從分子水平檢測蛋白組的翻譯情況，并了解蛋白質的翻譯水平及翻譯過程，在蛋白翻譯機制的研究領域中有廣闊的應用前景。
實驗流程圖
樣本要求：
樣品類型：
動物組織、植物組織、細胞、菌類以及客戶分離的RPF（核糖體復合物），其它類型樣品請詳詢。
樣品量：
a) 細胞：4×107
b) 細菌：4×107
c) 動物組織：≥ 400mg
d) 植物組織：≥ 400mg
e) 其它類型樣品用量請詳詢。
樣品的運輸與保存：
在簡單處理并標記后，液氮速凍，-80℃冰箱保存，以避免實驗操作前樣品降解的可能性。干冰運輸。
數據分析（僅供展示，詳見demo報告）
1、基因的識別和注釋
2、差異基因的篩選
使用edgeR或DESeq2對原始count進行標準化并計算兩組樣品間的倍數變化（fold chang）。如下表：
差異表達mRNA（例子）
3、差異基因 GO功能富集分析
4、差異基因KEGG通路分析
5、聚類圖
聚類圖可以用于衡量樣本或基因之間表達的相似性，通常來講，同組的樣品能夠聚在一個分支中。
差異表達基因聚類（例子）
6、散點圖
散點圖（例子）
7、火山圖
當兩組樣品比較時，利用倍數變化和P-value繪制火山圖，火山圖可以反映總體基因的表達情況。
注：兩個樣品比較不畫火山圖
火山圖（例子）
8、P-site
翻譯過程中，核糖體相對于RNA以密碼子長度（3 nt）為單位移動。因此，以 P位點為基準，來源于正常翻譯過程的 RPF 片段應該在 RNA 上呈現 3堿基的周期性分布。
P-site圖（例子）
9、差異TE基因篩選（同時進行mRNA-seq提供以下部分）
翻譯效率的改變是基因翻譯水平調控的主要形式，直接影響蛋白質的產量。翻譯效率（TE）：TE代表樣本中某個基因正在翻譯的mRNA的數量占總mRNA的比例，計算公式為：TE＝Norm data in Ribo-seq / Norm data in RNA-seq。
計算兩組樣品間的所有差異TE基因。以倍數變化（fold chang）>=2篩選差異TE基因。如下表：
10、差異TE基因散點圖
散點圖可直觀展示每個分組比較的差異TE基因分布情況。
散點圖（例子）
11、差異TE基因 GO功能富集分析
12、差異TE基因KEGG通路分析
案例分析
案例1：特異性tRNAs的表達調控驅動基因表達和癌癥進展
原文：Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression
期刊： Cell (2016) 影響因子：36.216
作者通過在5種細胞系中進行tRNA測序研究和Ribo-seq研究發現，在人類乳腺癌中特異性tRNAs：tRNAGluUUC 和tRNAArgCCG表達上調，可使癌細胞獲得轉移能力。研究者通過Ribo-seq檢測這些特殊tRNAs增多后轉錄本上的核糖體結合情況，結果顯示富集這些tRNA同源密碼子的轉錄本更加穩定，核糖體結合更多。特別是tRNAGluUUC通過直接增強EXOSC2表達與增強GRIPAP1來構成一條受tRNA驅使的“可誘導”通路，從而促進癌癥轉移。 因此，該研究說明tRNA是基因表達的動態調節因子，RNA調節是細胞實現特定轉錄物和蛋白質表達改變的一種機制。
案例2：人心臟的翻譯組學研究
原文： The Translational Landscape of the Human Heart
發表期刊： Cell (2019) 影響因子：36.216
基因在人體組織中的表達的研究主要集中在轉錄水平上，而翻譯調控常被忽視。本研究對65例擴張性心肌?。―CM）患者左心室心肌組織和15例正常對照組的左心室心肌組織進行mRNA測序（mRNA-seq）和核糖體印跡測序（Ribo-seq），分析了DCM與健康對照組中RNA分子翻譯效率的總體情況，結合先前研究的心臟組織蛋白質組學的數據，系統分析了左心室心肌組織中被翻譯的ORF以及對應的蛋白或多肽的總體信息。分析后發現在1090個uORF、 22335個傳統的ORF還包括了來自于169個lncRNA 的339個sORF。本文通過分析Ribo-seq數據鑒定出了169個lncRNA和40種環狀RNA (circRNAs)編碼的新的微蛋白，這表明這些微蛋白在人體中的生物學功能尚未被發現。而本研究中的這一發現可能為研究其他人類組織翻譯組學提供依據。
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