技術簡介
DNA甲基化修飾是表觀遺傳研究的熱點之一，我們通常認為DNA甲基化就是胞嘧啶甲基化（5-methylcytosine, 5mC），卻不知道隨著測序技術的快速發展，一種新的DNA甲基化修飾類型—DNA-6mA甲基化已經成為表觀遺傳學領域的研究熱點。 

云序生物率先開發了DNA-6mA測序技術—6mA-IP-seq。其原理類似于MeDIP的免疫共沉淀測序技術，利用特異性抗體富集6mA片段，擴增后進行高通量測序及甲基化分析，以較小的數據量，快速地繪制全基因組DNA甲基化水平的圖譜。

技術優勢

一站式服務：

客戶只需提供相關樣品的基因組DNA，云序生物為您完成從6mA-IP富集，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程

優化的實驗流程：

6mA-IP的富集效率是決定數據質量的關鍵，云序生物6mA-IP實驗采用預驗證的商業化抗體和精心優化的實驗流程，具有極高的效率和特異性

嚴格的質控：

實驗的各個關鍵步驟進行嚴格的質控，全程監控實驗質量，確?？蛻舻玫絻?質的數據

專業的生物信息學分析：

云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析需求

樣本要求

樣品類型：無降解且無RNA污染的DNA樣品(適用一切有參考基因組的物種)。

樣品需求量：

a）細胞 2×10⁷
b）組織 100 mg
c）gDNA 3μg

樣品濃度：不少于50ng/ul

樣品運輸及保存：

樣品運輸：樣品置于1.5mL Eppendorf 管中，封口膜封好，干冰運輸，DNA可用冰袋運輸。

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊切塊，液氮凍存后-80℃保存；DNA樣品短期內可-20℃，避免反復凍融。

云序數據分析（僅供展示，詳見demo報告）

1、DNA甲基化富集峰的識別

通過高通量測序和生物信息分析，識別甲基化富集的基因組區域，默認p <= 1e-5（具體參數以報告為準，云序生物會根據數據，適當調整參數）的峰為統計上明顯的甲基化區

注：每個樣品組做一個Input，以去除基因組背景，降低假陽性率

2、DNA甲基化區域富集峰的注釋 

富集峰識別后，得到的是一堆基因組位置信息，通過生物信息分析利用鄰近基因對富集峰進行注釋，并根據峰中點相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰

3、DNA甲基化富集峰區域的在基因中的分布※

4、差異DNA甲基化區域的鑒定（DMRs）與注釋 

云序生物使用diffReps軟件進行差異甲基化區（differentially methylated regions，DMRs）鑒定。默認p-value<0.0001，fold change >=2作為差異甲基化區的閾值

5、差異DNA甲基化區的GO（Gene Ontology）與信號通路分析

目的：對差異甲基化基因進行功能分類，并發現明顯富集的功能條目

6、DNA甲基化可視化

案例分析：

DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells.

期刊：Nature,影響因子：44.958

作者以SMRT-ChIP、RNA-seq和6mA-IP seq三種技術相結合的方法研究小鼠基因組甲基化。研究發現小鼠胚胎干細胞中存在另一種DNA甲基化修飾—6mA甲基化；Alkbh1是腺嘌呤甲基化修飾的一種去甲基化酶，在Alkbh1基因缺失突變小鼠細胞中腺嘌呤甲基化水平增加，進而導致轉錄沉默。揭示了哺乳動物表觀修飾的重要組成部分—6mA甲基化，在哺乳動物中發揮沉默基因表達的功能，而不是如其他生物體中激 活基因表達的作用。

                      6mA分析

6mA-IP seq分析

N6-Methyladenine DNA Modification in Drosophila.

期刊：Cell, 影響因子：31.398

作者以果蠅胚胎干細胞為材料，對其基因組中6mA修飾進行研究，發現在果蠅基因組中6mA修飾普遍存在，這種修飾受內源去甲基化酶DMAD調控，在胚胎發育過程中呈動態變化。進一步研究發現，DMAD酶作為果蠅胚胎發育所必須的一種酶，它作用于轉座子的6mA位點，去甲基化后，轉座子的表達受到抑制。該文章發現果蠅中DNA甲基化修飾新類型-6mA，并且初步探究了6mA甲基化的調控機制。

     6mA分布

6mA-IP seq與RNA-seq聯合分析