技術簡介 

外泌體（Exosomes）是一種直徑在40-100 nm的圓形單層膜結構，是細胞外泌囊泡中體積較小的一種。外泌體可被大多數細胞分泌，并分布于唾液、血漿、乳汁、尿液等體液中。外泌體中不僅包含蛋白質成分，還包括一些RNA成分，如微小RNA ( microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）、mRNA和環狀RNA（circular RNA，circRNA）。

LncRNA作為近幾年研究火熱的非編碼RNA，其各種重要功能逐漸被發現，許多與ai癥等惡性疾病密切相關。云序生物提供外泌體LncRNA測序，同時分析樣品中全部外泌體來源LncRNA和mRNA，我們不僅為客戶提供海量數據，更為客戶甄別有效數據，提供出版級別經典圖片。

云序優勢：

一站式服務：

客戶只需提供血清、血漿、體液或外泌體RNA，云序生物為您完成從樣品準備，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。 

專業化的生物信息學分析：

云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析要求。
樣本要求
樣品類型：

血清、血漿、細胞上清、體液或外泌體RNA樣品。其它類型樣品請詳詢。

樣品量：

a）血清：5 mL

b）血漿：5 mL

c）細胞上清：20 mL

d）體液：

唾液：15 mL

鼻涕：15 mL

尿液：100 mL

腦脊液：10 mL

e）外泌體總RNA 2 μg （OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.5; 無明顯降解，電泳檢測樣品特征性條帶完整清晰，無明顯彌散或拖尾 ）

樣品運輸及保存： 

樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。 

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；血液樣品應使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。 

數據分析 （下列有※表示個性化分析）

1、差異LncRNA的篩選 

目的：篩選（Fold Change≥ 2,  P值≤ 0.05）兩組或多組樣品間的差異表達LncRNA。
注：Fold Change代 表差異倍數，P值代 表差異明顯性，篩選中采用的倍數變化會根據具體數據情況進行調整

2、LncRNA靶基因共表達網絡分析（CNC）※

利用LncRNA與mRNA的共表達關系，構建LncRNA-mRNA共表達網絡圖，幫助發現LncRNA的靶基因，并推斷LncRNA的功能。

3、LncRNA靶基因集信號通路富集分析（LncRNA-GSEA）

篩選與LncRNA共表達的靶基因，然后通過GSEA分析發現這些靶基因參與的信號通路，發現LncRNA參與調控的主要信號通路，幫助確定LncRNA的功能。

4、LncRNA臨近靶基因GO和信號通路分析

搜索差異LncRNA的臨近基因，然后用差異表達的臨近基因進行GO富集分析和信號通路分析，了解LncRNA對臨近基因的影響，并以此推斷LncRNA參與的生物過程、分子功能和細胞組分。

5、LncRNA-miRNA-mRNA關聯分析※
一些LncRNA可以通過與miRNA結合，調節miRNA靶基因的表達。通過LncRNA-miRNA-mRNA關聯分析，可以幫助推斷作為miRNA海綿發揮作用的LncRNA以及作用機制。

6、LncRNA上游轉錄因子分析※
預測特定LncRNA上游的轉錄因子結合位點，幫助判定該LncRNA所受的調控機制。

案例解析

案例1：外泌體LncRNA促進腫 瘤細胞耐藥性

原文：Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA

期刊：Cancer Cell 影響因子：27.41

本文闡述了疾病相關LncRNA參與腎ai耐藥性及通過外泌體傳播的生理機制。首先，作者通過高通量手段檢測了野生型細胞和耐藥型細胞中差異表達的LncRNA，并通過病人源性異種移植模型(PDX)鑒定到8條疑似致病LncRNA。將其中一條LncRNA-LncARSR (Activated in RCC with Sunitinib Resistance)敲除后，細胞耐藥性明顯增強。進一步研究表明LncARSR與腎ai細胞增殖、粘附等表型密切相關。作者研究發現，LncARSR主要存在于細胞外泌體中，并且耐藥細胞外泌體LncRNA含量要遠高于野生型細胞。作者隨后通過RNA Pull Down實驗證實核不均一性核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)負責包埋LncARSR進入外泌體。當提取耐藥細胞外泌體孵育到野生型細胞后，野生型細胞胞內LncARSR含量增加，細胞耐藥性增強。而胞內LncARSR主要發揮miRNA海綿功能，通過競爭性結合miRNA-34和miRNA-449，促進AXL和c-MET表達及下游STAT3、AKT、ERK信號通路的活化，終導致舒尼替尼耐藥性形成。

圖1. 耐藥處理腫 瘤細胞后外泌體內LncRNA發生差異變化

案例2：腫 瘤缺氧環境促進外泌體ai癥LncRNA高表達

原文：Hypoxic exosomes facilitate bladder tumor growth and development through transferring long non-coding RNA-UCA1

期刊：Molecular Cell 影響因子：7.78

為克服實體腫 瘤的惡性缺氧微環境，腫 瘤細胞會分泌大量含非編碼RNA的外泌體，促進腫 瘤的發生和轉移。研究人員選取膀胱ai5637細胞系作為實驗供體組，其具有LncRNA-UCA1（尿路上皮ai相關1型LncRNA）高表達的特點；膀胱aiUMUC2細胞系作為實驗受體組，其具有LncRNA-UCA1低表達的特點。通過透射電子顯微鏡、納米粒子跟 蹤分析和蛋白質印跡分析分離并鑒定了在常氧及缺氧條件下5637細胞分泌的外泌體。將這些外泌體與UMUC2細胞共培養，發現來自5637細胞分離的缺氧外泌體會促進UMUC2細胞增殖、遷移和侵襲。與常氧狀態培養分離外泌體相比，5637細胞系的缺氧外泌體中LncRNA-UCA1表達水平較高。此外，缺氧外泌體LncRNA-UCA1可以在體外和體內通過上皮間質轉化促進腫 瘤生殖生長。除此之外，膀胱ai患者血清外泌體中LncRNA-UCA1的表達水平明顯高于健康對照組。本文證實缺氧膀胱ai細胞通過分泌富含致ai性LncRNA-UCA1的外泌體到腫 瘤微環境中，促進腫 瘤的生長和發育。并且，人血清外泌體LncRNA-UCA1具有作為膀胱ai診斷生物標志物的可能性。

圖2. 腫 瘤微環境影響外泌體LncRNA分泌