技術簡介

外泌體（Exosomes）是一種直徑在40-100 nm的圓形單層膜結構，是細胞外泌囊泡中體積較小的一種。外泌體可被大多數細胞分泌，并分布于唾液、血漿、乳汁、尿液等體液中。外泌體中不僅包含蛋白質成分，還包括一些RNA成分，如微小RNA ( microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、mRNA和環狀RNA（circular RNA，circRNA）。環狀RNA（circular RNA）是近來新發現的一種非編碼RNA分子，研究趨勢火爆。環狀RNA表達具有組織和疾病特異性，與組織發育、疾病發生 發展密切相關。此外環狀RNA不易降解，可做為新型疾病分子標志物。外泌體環狀RNA的研究勢必會為疾病診斷與治 療帶來極大幫助。

云序生物環狀RNA測序服務，采用Cloudseq CircRNA Enrichment Kit，能夠去除樣本中的線性mRNA和rRNA，能夠幫助客戶以合理的成本檢測到更多的環狀RNA。此外，Cloudseq CircRNA Enrichment Kit 覆蓋了幾乎全部已知物種，對環狀RNA的研究將不再局限于人、小鼠和大鼠等常見物種。 

云序優勢 

適用于任何物種： 

可以檢測幾乎任何動植物的環狀RNA。 

適用于降解樣品： 

可以檢測部分降解的樣品的環狀RNA。 

有效數據量高：

通過商業化kit富集環狀RNA，極大地提高了有效數據比例。

性價比高： 

能夠以較低的成本檢測更多的環狀RNA。 

一站式服務： 

客戶只需提供血清、血漿、細胞上清、體液或外泌體，云序生物為您完成從樣品準備、文庫制備、上機測序到數據分析的整套服務流程。 

專業化的生物信息學分析： 

云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析要求。 

樣本要求

樣品類型：

血清、血漿、細胞上清、體液或外泌體總RNA樣品。其它類型樣品請詳詢。 

樣品量： 

a）血清：5 mL

b）血漿：5 mL

c）細胞上清：20 mL

d）體液：

唾液：15 mL

鼻涕：15 mL

尿液：100 mL

腦脊液：10 mL

e）外泌體總RNA 2 μg （OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.5; 無明顯降解，電泳檢測樣品特征性條帶完整清晰，無明顯彌散或拖尾 ）
樣品運輸及保存：
樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；血液樣品應使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

數據分析（僅供展示  詳見demo報告）
1、環狀RNA的識別與注釋
通過環狀RNA高通量測序，采用嚴謹的生物信息分析學流程識別鑒定環狀RNA，并根據他們在基因組上位置和數據庫中來源進行注釋。云序生物整合了來自文獻、數據庫的多個物種的circRNAs，構成目前世界上較全的circRNA數據庫circDB，對環狀RNA的來源進行了注釋，并展示了環狀RNA與疾病的關系，以節省耗時的文獻查找和閱讀。

2、差異環狀RNA的篩選
按照預設的篩選標準（Fold Change≥2， P值≤ 0.05）篩選出差異表達的環狀RNA。
注：Fold Change代 表差異倍數，P值代 表差異明顯性，篩選中采用的倍數變化會根據具體數據情況進行調整

3、差異環狀RNA的聚類

4、差異circRNA的來源基因的GO和信號通路分析
對差異circRNA的來源基因進行功能和信號通路富集分析，以便推斷circRNA的功能。

5、circRNA-miRNA相互作用網絡※
通過circRNA-miRNA相互作用網絡分析，可以幫助解析作為miRNA海綿發揮作用的環狀RNA的功能以及作用機制。

6、環狀RNA的可視化
圖形化展示了環狀RNA在基因組中的分布，以及與之相應的線性RNA的位置關系。

案例解析
案例1：外泌體全轉錄組測序（云序客戶文章）

原文：Circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice

期刊：Journal of Neurotrauma 影響因子：5.19

近期，天津醫科大學總醫院張建寧教授帶領的神經創傷團隊針對大腦創傷的研究。應用全轉錄組測序技術，僅通過大腦創傷外泌體中環狀RNA表達譜研究發表了小鼠腦創傷模型外泌體環狀RNA研究成果。作者首先分離了小鼠腦組織，提取腦周質外泌體，通過外泌體全轉錄組測序檢測TBI腦周組織外泌體中環狀RNA的表達變化。結果發現231個差異表達的環狀RNA，其中155個上調，76個下調。接下來通過生信分析如GO及KEGG分析對外泌體差異表達的環狀RNA進行了功能預測。GO分析表明這些RNA分子主要參與神經損傷修復，神經系統發育及神經信號傳導相關，這些分子同時主要富集在cGMP-PKG信號通路。環狀RNA-miRNA互作網絡圖揭示了環狀RNA作用靶miRNA及可能的功能。本文研究了大腦創傷外泌體中環狀RNA變化，為后續分子機理詳細研究提供諸多靶分子，也為大腦創傷的干預治 療提供潛在的靶點。

圖1. 創傷小鼠外泌體電鏡及WB鑒定

圖2. 外泌體環狀RNA表達譜

圖3. 外泌體差異表達環狀RNA GO和KEGG分析

圖4. 外泌體差異表達環狀RNA-miRNA網絡圖