技術簡介

外泌體（Exosomes）是一種直徑在40～100 nm的圓形單層膜結構，是細胞外泌囊泡中體積較小的一種。外泌體可被大多數細胞分泌，并分布于唾液、血漿、乳汁、尿液等體液中。外泌體中不僅包含蛋白質成分，還包括一些RNA成分，如微小RNA ( microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA和mRNA、環狀RNA（circular RNA，circRNA）。外泌體所攜帶的這些RNA統稱為外泌體來源RNA，具有完整的序列結構和生物活性。

常規的轉錄組分析僅通過Oligo (dT) 法對mRNA進行富集和分析，會導致包括環狀RNA和相當比例LncRNA的丟失，無法準確、全 面地反映真實的轉錄組信息。云序生物外泌體全轉錄組測序服務采用去核糖體的建庫方案，同時檢測樣品中mRNA、LncRNA和環狀RNA，獲得全 面的轉錄組信息，進而針對不同類型的RNA進行表達分析，結構研究，變異研究以及新轉錄本的發現。

云序優勢
全 面的檢測類型的RNA：
常規的轉錄組測序采用Oligo d(T)法純化帶Poly(A)尾巴的RNA分子。然而很多熱門的RNA分子，如環狀RNA和部分LncRNA，沒有Poly(A)尾巴，因此在處理過程中會被丟失掉。云序生物擁有市面上較全的，針對不同物種的去rRNA試劑盒，能夠全 面保留類型的RNA信息
適用于降解樣品：
云序生物采用特有的，可適用于降解樣品的試劑盒，能夠較大程度的保留降解樣品中的RNA信息。尤其適合于臨床樣品的轉錄組檢測
鏈特異性檢測：
很多基因位點會生成轉錄方向相反的、具有重要調控功能的反義RNA。常規的建庫方法無法區分這些反義RNA，而云序生物采用鏈特異性的建庫方法，可以準確檢測反義RNA，從而提供更全 面的轉錄組信息
一站式服務：
客戶只需提供細胞，組織，體液或總RNA，云序生物為您完成從樣品準備，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程
專業化的生物信息分析：
云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析要求

樣本要求
樣品類型：
細胞、體液、總RNA。其它類型樣品請詳詢。
樣品量：

a）血清：5 mL

b）血漿：5 mL

c）細胞上清：20 mL

d）體液：

唾液：15 mL

鼻涕：15 mL

尿液：100 mL

腦脊液：10 mL

e）外泌體總RNA 2 μg （OD260/280≥1.8；OD260/230≥1.5; 無明顯降解，電泳檢測樣品特征性條帶完整清晰，無明顯彌散或拖尾 ）

樣品運輸及保存：

樣品運輸：樣品置于1.5mLEppendorf管中，封口膜封好，干冰運輸。

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；血液樣品應使用EDTA抗凝，不可用肝素；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

數據分析（僅供展示  詳見demo報告）

1、差異表達mRNA/環狀RNA/LncRNA篩選

根據高通量測序結果，篩選出（Fold Change≥2， P值≤ 0.05）差異表達mRNA/環狀RNA/LncRNA。
注：Fold Change代 表差異程度，P值代 表差異的明顯，篩選中采用的倍數變化會根據具體數據情況進行調整。

2、差異表達mRNA/環狀RNA/LncRNA的聚類

3、差異表達mRNA/環狀RNA/LncRNA的GO和信號通路分析
對差異mRNA/環狀RNA/LncRNA的來源基因進行功能和信號通路富集分析，以便推斷mRNA/環狀RNA/LncRNA的功能。

4、LncRNA-mRNA共表達網絡（CNC網絡）構建
利用LncRNA與mRNA的共表達關系，構建LncRNA-mRNA共表達網絡圖，幫助發現LncRNA的靶基因，并推斷LncRNA的功能

5、競爭性內源RNA（ceRNA）分析
通過circRNA-miRNA相互作用網絡分析，可以幫助解析作為miRNA海綿發揮作用的環狀RNA的功能以及作用機制。

6、circRNA-miRNA-gene網絡構建
一些LncRNA可以通過與miRNA結合，調節miRNA靶基因的表達。通過LncRNA-miRNA-mRNA關聯分析，可以幫助推斷作為miRNA海綿發揮作用的LncRNA以及作用機制。

案例解析
案例1：外泌體全轉錄組測序（云序客戶文章）

原文：Circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice

期刊：Journal of Neurotrauma 影響因子：5.19

近期，天津醫科大學總醫院張建寧教授帶領的神經創傷團隊針對大腦創傷的研究。應用全轉錄組測序技術，僅通過大腦創傷外泌體中環狀RNA表達譜研究發表了小鼠腦創傷模型外泌體環狀RNA研究成果。作者先分離了小鼠腦組織，提取腦周質外泌體，通過外泌體全轉錄組測序檢測TBI腦周組織外泌體中環狀RNA的表達變化。結果發現231個差異表達的環狀RNA，其中155個上調，76個下調。接下來通過生信分析如GO及KEGG分析對外泌體差異表達的環狀RNA進行了功能預測。GO分析表明這些RNA分子主要參與神經損傷修復，神經系統發育及神經信號傳導相關，這些分子同時主要富集在cGMP-PKG信號通路。環狀RNA-miRNA互作網絡圖揭示了環狀RNA作用靶miRNA及可能的功能。本文研究了大腦創傷外泌體中環狀RNA變化，為后續分子機理詳細研究提供諸多靶分子，也為大腦創傷的干預治 療提供潛在的靶點。

圖1. 創傷小鼠外泌體電鏡及WB鑒定

圖2.外泌體環狀RNA表達譜

圖3.外泌體差異表達環狀RNA GO和KEGG分析

圖4.外泌體差異表達環狀RNA-miRNA網絡圖