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近年來,科學家們發現了一種可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發生甲基化修飾(N6-methyladenosine,m6A)。研究發現,m6A是真核生物mRNA上常見的一種轉錄后修飾,m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,以及在細胞分化、胚胎發育和壓力應答等過程中起重要作用。
m6A MeRIP-Seq(Methylated RNA Immunoprecipitation,MeRIP)是研究轉錄組表觀修飾的關鍵技術,基于m6A修飾抗體特異性識別并結合m6A修飾RNA的原理,以免疫共沉淀方法富集RNA片段,并配合高通量測序技術,實現轉錄組范圍內甲基化的RNA區域的檢測。MeRIP測序技術技術成熟、適用于各類分子(mRNA,LncRNA,circRNA,pri-miRNA等)。云序生物通過添加Spike-In實現更加準確的m6A檢測。
常規的MeRIP實驗通過修飾抗體富集修飾RNA,眾所周知,抗體特異性的強弱是決定MeRIP實驗是否成功的關鍵,沒有spike in,將難以確定實驗是否成功、有效RNA是否富集,也難以確定RNA甲基化修飾的豐度和變化,那么就無法保證測序結果真實可靠、質量達標。
MeRIP實驗質控金標準 Spike-In
云序生物m6A MeRIP-Seq(Spike-In Plus)測序在實驗過程中加入兩類人工合成的spike in,分別為陽性Spike-In(帶m6A修飾的序列)和陰性Spike-In(不帶修飾的序列),與樣品一起進行MeRIP-Seq實驗,根據spike in的檢測信號對MeRIP實驗進行質控,來確保實驗流程的準確性、重復性及抗體的特異性。
樣本要求:
樣品類型:
細胞、組織或RNA,其他樣本類型請電詢。
樣品量:
a) 細胞:2×107
b) 組織:100 mg-1 g
c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)
樣品運輸及保存:
樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。
樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。
云序數據分析(僅供展示,具體請參考demo報告)
1、甲基化基因識別與注釋(mRNA,pri-miRNA)
使用MACS檢測樣本信號,根據IP和Input的信號比值,識別基因甲基化區域。
2、差異甲基化基因識別(mRNA,pri-miRNA)
使用diffReps軟件進行差異甲基化位點的識別
3、差異甲基化基因GO分析
4、差異甲基化基因KEGG分析
5、venn圖
6、修飾區域Motif分析
7、修飾區域位點分布
8、修飾位點甲基化密度圖
9、修飾位點可視化
10、四象限圖※
案例分析
案例1:擬南芥花葉根組織m6A RNA甲基化譜
原文:Transcriptome-wide high-throughput deep m6 A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana
期刊:Genome Biology 影響因子:13.21
西北農林科技大學聯合中科院和普渡大學,借助m6A RNA甲基化測序技術,對比擬南芥花,葉,根組織中(每種組織有兩個生物學重復)m6A RNA甲基化情況。結果發現檢測組織中m6A RNA甲基化修飾程度比人類高10%左右,占轉錄組的83%。
圖1. 比較擬南芥花,葉,根組織中m6A RNA甲基化情況
案例2:不同品系擬南芥m6A RNA甲基化譜
原文:Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana
期刊:Nature communications 影響因子:12.12
芝加哥大學聯合北大,利用m6A RNA甲基化測序對比和品系擬南芥根組織中m6A RNA甲基化譜,發現的分布在兩個品種間高度保守。與人類m6A RNA甲基化位點分布情況相比,擬南芥甲基化位點在起始翻譯區特異性高表達。
圖2. 不同品系,同一基因上甲基化
案例3:m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過結合lncRNA促進膠質瘤細胞
原文:m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program
期刊:Cancer Cell 影響因子:27.43
世界衛生組織將膠質瘤分為四級,其中惡性膠質瘤(GBM)屬于極危險的第四級,手術治 療和化療都難以避免其高復發率。近年來,m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學領域前沿研究之一,不斷有高影響分子文章問世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來越清晰,此時人們更關心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經膠質瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質瘤干性樣細胞表達上調,而ALKBH5高表達的膠質細胞瘤患者預后生存率更差。通過敲低ALKBH5,meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式,基因芯片檢測差異表達>2倍的基因,終篩選到與細胞周期調控相關的FOXM1基因,其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化,增加FOXM1表達。隨后作者發現FOXM1反義長鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424),與FOXM1 mRNA外顯子有457個核苷酸互補。結果證實ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,發揮促進惡性膠質瘤腫 瘤形成作用。
圖3. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,促進惡性膠質瘤腫 瘤形成m6A
近年來,科學家們發現了一種可逆的RNA甲基化—m6A,即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上發生甲基化修飾(N6-methyladenosine,m6A)。研究發現,m6A是真核生物mRNA上常見的一種轉錄后修飾,m6A在細胞加速mRNA代謝和翻譯,以及在細胞分化、胚胎發育和壓力應答等過程中起重要作用。
m6A MeRIP-Seq(Methylated RNA Immunoprecipitation,MeRIP)是研究轉錄組表觀修飾的關鍵技術,基于m6A修飾抗體特異性識別并結合m6A修飾RNA的原理,以免疫共沉淀方法富集RNA片段,并配合高通量測序技術,實現轉錄組范圍內甲基化的RNA區域的檢測。MeRIP測序技術技術成熟、適用于各類分子(mRNA,LncRNA,circRNA,pri-miRNA等)。云序生物通過添加Spike-In實現更加準確的m6A檢測。
常規的MeRIP實驗通過修飾抗體富集修飾RNA,眾所周知,抗體特異性的強弱是決定MeRIP實驗是否成功的關鍵,沒有spike in,將難以確定實驗是否成功、有效RNA是否富集,也難以確定RNA甲基化修飾的豐度和變化,那么就無法保證測序結果真實可靠、質量達標。
MeRIP實驗質控金標準 Spike-In
云序生物m6A MeRIP-Seq(Spike-In Plus)測序在實驗過程中加入兩類人工合成的spike in,分別為陽性Spike-In(帶m6A修飾的序列)和陰性Spike-In(不帶修飾的序列),與樣品一起進行MeRIP-Seq實驗,根據spike in的檢測信號對MeRIP實驗進行質控,來確保實驗流程的準確性、重復性及抗體的特異性。
樣本要求:
樣品類型:
細胞、組織或RNA,其他樣本類型請電詢。
樣品量:
a) 細胞:2×107
b) 組織:100 mg-1 g
c) RNA:30-300 μg(OD260/280:1.6-2.3;RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7)
樣品運輸及保存:
樣品運輸:樣品置于1.5mL離心管中,封口膜封好,干冰運輸。
樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理,液氮凍存后-80℃保存;RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存,避免反復凍融。
云序數據分析(僅供展示,具體請參考demo報告)
1、甲基化基因識別與注釋(mRNA,pri-miRNA)
使用MACS檢測樣本信號,根據IP和Input的信號比值,識別基因甲基化區域。
2、差異甲基化基因識別(mRNA,pri-miRNA)
使用diffReps軟件進行差異甲基化位點的識別
3、差異甲基化基因GO分析
4、差異甲基化基因KEGG分析
5、venn圖
6、修飾區域Motif分析
7、修飾區域位點分布
8、修飾位點甲基化密度圖
9、修飾位點可視化
10、四象限圖※
案例分析
案例1:擬南芥花葉根組織m6A RNA甲基化譜
原文:Transcriptome-wide high-throughput deep m6 A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana
期刊:Genome Biology 影響因子:13.21
西北農林科技大學聯合中科院和普渡大學,借助m6A RNA甲基化測序技術,對比擬南芥花,葉,根組織中(每種組織有兩個生物學重復)m6A RNA甲基化情況。結果發現檢測組織中m6A RNA甲基化修飾程度比人類高10%左右,占轉錄組的83%。
圖1. 比較擬南芥花,葉,根組織中m6A RNA甲基化情況
案例2:不同品系擬南芥m6A RNA甲基化譜
原文:Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana
期刊:Nature communications 影響因子:12.12
芝加哥大學聯合北大,利用m6A RNA甲基化測序對比和品系擬南芥根組織中m6A RNA甲基化譜,發現的分布在兩個品種間高度保守。與人類m6A RNA甲基化位點分布情況相比,擬南芥甲基化位點在起始翻譯區特異性高表達。
圖2. 不同品系,同一基因上甲基化
案例3:m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通過結合lncRNA促進膠質瘤細胞
原文:m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program
期刊:Cancer Cell 影響因子:27.43
世界衛生組織將膠質瘤分為四級,其中惡性膠質瘤(GBM)屬于極危險的第四級,手術治 療和化療都難以避免其高復發率。近年來,m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學領域前沿研究之一,不斷有高影響分子文章問世。m6A RNA修飾的催化、去除以及識別的分子機理研究越來越清晰,此時人們更關心m6A RNA修飾與重大疾病之間的相關性。近期Cancer Cell報道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神經膠質瘤中具有生理作用。在本研究中,去甲基化酶ALKBH5在惡性膠質瘤干性樣細胞表達上調,而ALKBH5高表達的膠質細胞瘤患者預后生存率更差。通過敲低ALKBH5,meRIP鑒定m6A RNA甲基化修飾模式,基因芯片檢測差異表達>2倍的基因,終篩選到與細胞周期調控相關的FOXM1基因,其在GSCs的自我修復和腫 瘤形成中起到關鍵作用。ALKBH5促使ai基因FOXM1轉錄本去甲基化,增加FOXM1表達。隨后作者發現FOXM1反義長鏈非編碼RNA——FOXM1-AS(LOC100507424),與FOXM1 mRNA外顯子有457個核苷酸互補。結果證實ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,發揮促進惡性膠質瘤腫 瘤形成作用。
圖3. ALKBH5和FOXM1-AS可與FOXM1協同作用,促進惡性膠質瘤腫 瘤形成m6A
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