技術簡介

細胞中存在一類被稱作R-loop的特殊三鏈核酸結構，由DNA-RNA雜交體和相關的非模板單鏈DNA組成。哺乳動物細胞中約有5%的區域會形成R-loop，多數集中在轉錄起始區和轉錄終止區，由RNA Pol I，II與III轉錄的RNA均可與DNA形成R-loop，表明其可來源于幾乎所有類型的RNA。R-loop可以在細菌到人類等生物體細胞內頻繁的形成，進而影響轉錄并導致基因組的不穩定性，異常R-loop的形成和積累與許多疾病的發生發展具有密切關系，解析R-loop的分布和調控基因表達的機制十分重要。

DRIPc-seq可以應用于任何細胞類型，只要可以收集足夠的起始材料，都可以準確繪制R-loop在各種細胞系和不同條件下的分布。在全基因組范圍內提供可重復的、高分辨率的、鏈特異性的R-loop圖譜。

實驗原理

DRIPc-seq是一種高分辨率和鏈特異性的方法，可以精確地繪制全基因組的R環。簡單地說，經過溫和的DNA提取和限制性內切酶酶切片段化后，用S9.6抗體對R環結構進行免疫沉淀實驗（該抗體對RNA-DNA雜交物顯示出亞納摩爾親和力，對雙鏈DNA幾乎沒有親和力）。雜交體的RNA鏈通過DNase I處理釋放，并用dUTP進行逆轉錄合成第二條鏈。隨后用尿嘧啶- N -糖基酶（UNG）處理，確保了文庫僅由一條鏈構建。然后在滿足質量控制后對cDNA進行擴增和測序。

DRIPc-seq流程圖

產品優勢

靈敏度高：能夠得到全基因組范圍內的R-loop圖譜

特異性好：背景噪音低，所需測序深度少

鏈特異性：采用鏈特異性建庫，保留鏈的信息

實驗重復性好：實驗重復結果一致性好

樣品要求

樣品類型

組織、細胞、總DNA或IP后DNA。其它類型樣品請詳詢。

樣品量

a) 細胞：2×10⁷

b) 組織：100 mg

c) 總DNA：> 30 μg

樣品運輸及保存

樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊，液氮凍存后-80℃保存；DNA樣品-80℃保存，避免反復凍融。

案例分析

原文：High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA–RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing

期刊：NATURE PROTOCOLS        發表時間：2019.5.3      影響因子：14.8

通過DRIP-seq和DRIPc-seq進行R環定位，能夠測量任何感興趣的基因組中r環結構的穩態分布。更重要的是，這些方法可用于由遺傳擾動（基因敲除或敲低）或化學處理（藥物，激素）引起的R環分布或動力學的全局變化。已發表的例子包括人乳腺癌細胞對雌激素轉錄誘導的反應或沉默人HEK293細胞中DNA拓撲異構酶1的后果。利用DRIPc-seq在小鼠細胞和酵母中成功地檢測到了R-loop譜。