CHIRP(ChromatinIsolation by RNA Purification)是一種檢測與RNA結合的DNA和蛋白質相互作用的方法，可同時分析lncRNA/circRNA 、蛋白及DNA三者互作關系。利用ChIRP-seq技術可用于在全基因范圍內定位lncRNA/circRNA的結合位點和可能結合的其他RNA分子，是揭示lncRNA/circRNA 生物學機制的關鍵實驗手段。

ChIRP-seq技術原理

ChIRP是通過針對目標RNA序列，以100nt長度為間隔設計長度為20-30nt的特異性反向互補生物素探針，并對所有探針位置按照按照5’-3’方向進行編號，以奇數組為一組（odd組），偶數組為一組（even組），分別進行后續實驗。探針通過與目標RNA進行特異性結合，通過磁珠下拉，與其共同作用的DNA與蛋白質就會吸附在鏈霉親和素磁珠上，一同被富集下來。對富集下來的DNA和蛋白質進行分離，通過測序來檢測結合DNA序列，或通過質譜來檢測結合蛋白。

實驗流程簡述為：①細胞交聯并收集沉淀?細胞裂解?探針制備?免疫沉淀?RNA、DNA、蛋白洗脫?測序/LC-MS檢測

云序技術優勢

優勢1：嚴格的質控，更可靠的實驗結果

云序生物在實驗中設置陽性對照與陰性對照，確保探針特異性以及實驗結果準確性，確?？蛻舻玫絻炠|、真實的數據。

優勢2：適用于任何LncRNA/CircRNA，不受RNA二級結構影響

針對RNA全長序列設計多段探針，只需知道分子序列長度，無需了解其二級結構及功能域。

優勢3：“分組探針”設計，精確捕捉結合位點

針對RNA序列每隔100bp設計一段引物，引物覆蓋分子全長，不受RNA復雜結構影響。同時將所有探針位置按照按照5’-3’方向進行編號，以奇數組為一組（odd組），偶數組為一組（even組），分別進行后續下拉實驗。選取兩組共同檢測信號為真實檢測數據。

優勢4：可同時研究多種分子互作機制

可同時研究LncRNA/CircRNA，蛋白質，DNA互作，也可以分別研究它們兩兩互作機制

云序產品

• ChIRP-seq：檢測與目標LncRNA/CircRNA結合的所有DNA/RNA

• ChIRP-MS：檢測與目標LncRNA/CircRNA結合的所有蛋白質

• ChIRP-qPCR：驗證目標DNA/RNA與目標LncRNA/CircRNA結合

• ChIRP-WB：驗證目標蛋白質與目標LncRNA/CircRNA結合

案例解析

案例1：通過ChIRP-seq發現LncRNA-FOXD2-AS1結合TRIB3啟動子區，抑制其轉錄活性

題目：The long non-coding RNA FOXD2-AS1 promotes bladder cancer progression and recurrence through a positive feedback loop with Akt and E2F1

期刊：cell death & disease

作者通過ChIRP-seq對LncRNA-FOXD2-AS1結合DNA進行測序。發現FOXD2-AS1 與 TRIB3 的啟動子形成 RNA-DNA 復合物，其轉錄活性隨后受到抑制，并導致 Akt 的激活，從而進一步增加 E2F1 的表達，E2F1 是參與 G/S 轉變的重要轉錄因子。E2F1可以與FOXD2-AS1啟動子區域結合，并隨后增強其轉錄活性，表明FOXD2-AS1/Akt/E2F1形成了反饋環。綜上所述，這種正反饋的調控模式可能是治療膀胱癌的新靶點，FOXD2-AS1有可能成為一種新的復發預測因子。

案例2：通過ChIRP-MS系統發現Xist RNA結合蛋白

題目：Systematic discovery of Xist RNA binding proteins

期刊：Cell

作者通過質譜（ChIRP-MS）對RNA結合蛋白的綜合鑒定。對四種 ncRNA 進行 ChIRP-MS 分析捕獲關鍵的香花作用蛋白質。揭示了Xist lncRNA以模塊化和發育控制的方式與蛋白質結合，以協調染色質擴散和沉默。