轉錄組分析的核心目標是準確定量樣品中RNA轉錄本的豐度。

RNA-seq的流程為：RNA片段化→cDNA合成→加接頭→PCR擴增→測序。但由于在進行RNA測序時，逆轉錄、加接頭、PCR文庫擴增、測序序列依賴性偏差和擴增噪聲等原因，使得常規RNA-Seq的結果準確度下降。

 2012年PNAS報道了一種可以降低RNA-Seq偏倚和噪音的方法，也是我們常說的UMI-RNA-Seq。

RNA測序在文庫構建時，都需要通過PCR擴增，產生重復的分子片段，但是所有的文庫片段并非以同等速率等量的擴增，擴增速率受到片段長度、GC含量、片段濃度等多方面的影響，容易擴增的片段被極大的富集，一些含量較低的片段或堿基偏好嚴重的片段甚至完全丟失，最終影響測序結果的準確性。

UMI-RNA-Seq是在每個cDNA分子擴增之前連接特異序列標簽（UMI，Unique Molecular Identifier），這些標簽（UMI）會隨cDNA序列一起擴增測序。測序完成后，通過識別UMI標簽，將具有相同數字標簽的重復片段合并，消除PCR擴增中的偏好性（去除PCR擴增及測序儀引起的重復），就可以定量原始樣本中cDNA分子的數量。

 UMI消除PCR擴增偏好，但UMI≠絕對定量測序！

相比常規轉錄組測序，通過添加UMI特異性標簽，轉錄本測序定量的準確性確實能夠實現大幅提高，但通過UMI-RNA-Seq就能真正的實現絕對定量測序嗎？

根據上述UMI-RNA-Seq的原理，我們可以發現UMI特異標簽能夠很好的消除文庫構建過程中PCR擴增及測序儀引起的偏好性和重復性。但在測序過程中不止PCR擴增過程會產生干擾，逆轉錄突變、建庫過程技術誤差、測序數據量差異等都會導致轉錄組測序準確性下降，因此僅僅通過UMI標簽不能完全消除這些差異，無法實現真正意義上的絕對定量測序。

云序生物UMI + spike-in矯正實現更精準定量測序??！

為了彌補UMI-RNA-Seq方法無法消除的逆轉錄突變、試驗技術誤差、測序結果數據量差異等缺點，云序生物聯合UMI-RNA-Seq與spike-in矯正共同實現對轉錄組測序的精準絕對定量！

Spike-in是什么？

Spike in標準物，也稱為外源性內標，是指在每個樣品中加入等量的已知序列信息的非親緣標準品基因組，與實驗樣品共同進行文庫構建，這樣在進行RNA-Seq測序時就可以通過不同樣本之間內參（spike-in）量，非常準確地對不同樣本之間的表達量進行矯正，很好的彌補UMI無法消除的偏差，從而實現測序高準確性定量。

a. 當基因組各處都發生相同程度的變化時，將總測序reads歸一化為相同的數字會隱藏變化，而將spike-in的reads歸一化為相同的數字會揭示reads密度的全局變化。
b. 當特定基因組區域發生信號增加時，標準化樣本之間的總測序reads會導致來自基因組其他區域的reads數量人為減少，這就會錯誤地解釋為在特定實驗條件下減少。而通過使用spike-in的reads作為標準化，可以避免這種人為的變化。

 技術優勢

技術適用范圍

• 適用于全轉錄組測序、mRNA 測序、LncRNA測序、circRNA 測序等多種RNA測序

• 適用于MeRIP-m6A--Seq 、MeRIP-m5C-Seq、acRIP-Seq 等多種 RNA 修飾測序

數據示例（僅供展示  詳見demo報告）

 轉錄組測序結果示例

RNA修飾測序結果示例

為MeRIP實驗的準確性及數據有效性提供了有力支持！

陽性（添加了相應修飾的spike in）：檢測到較高的信號值

陰性（添加了不帶修飾的spike in）：幾乎檢測不到信號值