m6Am-Exo-seq mRNA測序
RNA m6Am 修飾簡介
RNA 修飾在基因表達調控中扮演著非常重要的角色。m6A 修飾就是真核生物 mRNA 中較常見存在的一種修飾形式，得到了常見的關注和研究。除此之外，還存在著一種分子結構上非常相似的 RNA 修飾形式：m6Am——在 m6A 修飾的基礎上，同一個腺苷酸殘基的核糖的 2’ 羥基也被甲基化，產生 2’ 甲氧基結構（2’-O-CH3）。與 m6A 的常見分布所不同的是，m6Am 修飾的分布主要局限于 mRNA 5’ 帽子結構下游的較早核苷酸殘基上發生。該位點的 m6Am 修飾在進化上高度保守，無論是在斑馬魚、小鼠還是人類細胞中均有發現。研究還發現，m6Am 修飾是一個可逆的動態修飾，當細胞遭遇熱激、低氧等應激性刺激時 m6Am 水平上升，說明 m6Am 可能在細胞應激反應中扮演了重要角色。近來也有研究發現，m6Am除發生在mRNA外，在 snRNA 內部也有 m6Am 甲基化修飾的分布。雖然 m6Am 修飾早在 1975 年就已經被人類發現，但由于檢驗手段的匱乏，科學家難以區分出 m6A 修飾與 m6A 修飾，因此直到近年來 m6Am 測序技術逐漸發展成熟，才為進一步深入研究 m6Am 這一重要的 RNA 修飾鋪平了道路。

m6Am 形成的機理
在生物體中，m6Am 的形成和消去是一個可逆的動態過程。PCIF1 催化 m6Am 修飾的形成（作為 m6Am “Writer”）；而 FTO 則可以催化 m6Am 修飾的消去（作為 m6Am “Eraser”）。近來也有研究發現，除了 mRNA 的較早編碼核苷酸殘基以外，在 snRNA 中的特定 motif 也存在內部 m6Am 修飾位點，以 METTL4 催化該甲基化反應（作為“內部 m6Am Writer”）。
mRNA m6Am-Exo-seq 測序服務

云序生物在國內首批引入 m6Am-Exo-seq 測序服務，利用 5’ 核酸外切酶消除非目的性的 RNA 片段上 m6A 修飾的信號干擾，選擇性地獲取 mRNA 5’ 帽子結構下游 m6Am 修飾富集區域的序列信息。對選擇性獲取到的 m6Am 修飾的 RNA 片段進行反轉錄建庫和高通量測序，可為后續的生物信息學分析提供豐富的數據，進而揭示差異性 m6Am 修飾位點的特征及其可能的生物學功能，為您的科研課題提供強勁的助力。 

云序優勢
國內 RNA 修飾測序領域的先行者
云序生物率先在國內實現多類 RNA 修飾測序的商業化服務，擁有豐富的經驗和可靠的實驗和技術團隊，助力客戶首發 10 分以上的 RNA 甲基化研究文章。
專業的生物信息學分析
云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析要求。
一站式服務
客戶只需提供細胞、組織、體液或總RNA，云序生物為您完成從 m6Am RNA 富集、文庫制備、上機測序到數據分析的整套服務流程。
樣品要求
樣品類型
細胞、組織或RNA，其他樣本類型請電詢。
樣品量
組織：100 mg – 1 g 
細胞：2× 10⁷ 個以上
RNA：30-300 μg  （OD260/280：1.6-2.3；RNA無明顯降解28S:18S>1.5或RIN>7）
樣品保存與運輸
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊（切成 5-10 mg 的小塊），可用 TRIzol 或 RNA 保護劑處理，液氮凍存后，-80℃ 保存， RNA 樣品可溶于乙醇或 RNA-free 的超純水中，-80℃ 保存，樣品保存期間避免反復凍融。
樣品運輸：樣品置于 1.5 mL 離心管中，封口膜封好，埋在盛有干冰的泡沫盒中運輸。

案例解析
案例1: m6Am 測序揭示了人類轉錄組中 m6Am 甲基化的動態性
原文：m6Am-seq reveals the dynamic m6Am methylation in the human transcriptome
期刊：Nature Communication 影響因子：13.78
北京大學的研究人員開辟了一種新型的 m6Am 修飾 RNA 的測序方法，使用抗體拉取 5’ 帽子片段富集 m6Am 修飾的 RNA 區域，再在特定生化環境條件下使用 FTO 酶來區分 m6Am 與 m6A 修飾，進而可達到精細至單堿基水平的 m6Am RNA 測序。使用該方法對人類轉錄組測序的結果顯示，m6Am 修飾的分布主要局限于 mRNA 5’ 帽子下游的翻譯起始位點，并且多數具有 BCA 的序列 motif 特征（B=C/U/G）。對細胞施予熱激、低氧等應激性刺激時，細胞轉錄組的 m6Am 水平有明顯上升，說明 RNA 的 m6Am 動態修飾可能參與了細胞應激性反應。針對低氧環境刺激的進一步 GO 分析顯示，m6Am 水平升高的基因與內質網應激調節的生物學過程有關?；谏鲜鲂掳l現，作者闡明了 m6Am 在人類 mRNA 上的分布特點，并揭示了 m6Am 修飾與細胞應激反應之間的關聯關系。在本文的研究思路當中，精確到單堿基水平的 m6Am 測序是一個新穎的實驗方法。

低氧環境下，人類細胞 HEK293T 細胞的 m6Am 修飾變化的火山圖

原文：METTL4 catalyzes m6Am methylation in U2 snRNA to regulate pre-mRNA splicing
期刊：Necleic Acids Research 影響因子：16.48
新加坡南洋理工大學的研究人員通過人類全轉錄組 RNA 甲基化測序，在 Mettl4 敲除組與野生型對照組之間尋找出 m6Am 相對甲基化水平的差異位點，其中 U2 snRNA 的第 30 位 RNA 殘基有明顯的 m6Am 修飾水平差異。進一步的 FLAG-tag 融合蛋白實驗證明，METTL4 蛋白直接催化了 U2 snRNA 上的 m6Am 甲基化修飾的發生。METTL4 過表達實驗發現，其催化的 RNA 內部 m6Am 修飾位點具有 HMAGKD 的序列 motif 特征（H=A/C/U, M=A/C, K=G/U, D=A/G/U）。 在 Mettl4 敲除的人類細胞中，因為 U2 snRNA 無法完成 m6Am 修飾，故而對 snRNA 的 pre-mRNA 剪接功能產生了諸多影響，例如 3’ 可變剪接位點的下調以及“外顯子增加”（exon inclusion）的上調等?；谏鲜鲂掳l現，作者揭示了 mRNA 以外的 m6Am 修飾的存在及其生物學意義。在本文的研究思路當中，采用能夠區分 m6Am 與 m6A 修飾的 RNA 測序方法是成功的基石。