環狀DNA簡介
游離于染色體基因組之外的DNA (extrachromosomal DNA，ecDNA)被發現常常以環狀的形式存在，這種形式的DNA被稱為環狀DNA (extrachromosomal circular DNA，eccDNA）。目前也習慣將巨大的環狀DNA(>1Mb)稱為ecDNA, 而將相對較小的環狀DNA稱為eccDNA。
傳統觀點認為真核基因組通常形成穩定的線性染色體。但最新的研究表明：無論是在正常體細胞還是癌細胞中，都存在大量染色體外環狀DNA。近日，Nature雜志上發表了顛覆性研究成果：在腫瘤中，主要的癌基因轉錄本是直接來自于環狀DNA的，而環狀DNA的染色質是高度開放的，環狀DNA的癌基因能夠大量表達，同時缺乏絲粒，導致不遵照孟德爾定律進行遺傳，這種特性使得環狀DNA是驅動腫瘤異質性的重要機制。由此可見，由于其結構和表達的特異性，環狀DNA可以影響細胞生命活動，促進腫瘤細胞演進和適應性進化，增加了基因組的可塑性和不穩定性。目前，環狀DNA不僅僅可以作為一種新型特異的腫瘤標志物，還在腫瘤發生發展機理研究中發揮著重大的潛在價值?？梢灶A見的是，環狀DNA將迅速成為新的科研熱點，甚至會對傳統遺傳學和基因組學帶來革命性影響。

技術簡介

針對測序項目中篩選出的環狀DNA，云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。通過設計反向引物進行PCR擴增，驗證連接位點處序列。通過反式PCR擴增出來的產物，將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序，精確證實連接位點。通過sanger低通量測序，一方面更加嚴謹地核實了所挑選出的環狀的連接位點，第二方面驗證了高通量測序和分析識別環狀DNA的準確性，第三方面可以確認某些高通量測到表達量較低的環狀確實存在。

實驗方法

1. PCR 擴增
2. 瓊脂糖電泳及膠回收
3. Sanger 測序及結果分析

樣本要求

樣品類型：
組織、細胞、血清血漿或DNA樣品。
樣品量：
a）細胞：2×10⁷
b）組織：200mg
c）血清血漿：5mL
d）DNA：>=10 μg，溶于無菌水或 TE（PH = 8）（OD 260/280值應在1.7～2.0 之間；RNA 應該去除干凈；不得有其它個體或其它物種的DNA污染）。
樣品運輸及保存：
樣品運輸：樣品置于1.5mL Eppendorf管中，封口膜封好，干冰運輸，DNA可用冰袋運輸。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊切塊，液氮凍存后-80℃保存；DNA樣品短期內可-20℃，避免反復凍融。

數據分析（僅供展示  詳見demo報告）

1. 環狀DNA特異性的junction位點分析