核糖核酸結合蛋白(RBPs)是調控基因表達的關鍵角色，通過控制RNAs在細胞內被降解，加工和翻譯的時間、地點和速度，在細胞生理中發揮重要作用。目前廣泛使用RNA免疫沉淀(RIP)和紫外光交聯和免疫沉淀(CLIP)等技術來識別RBP。增強交聯形免疫沉淀技術 eCLIP-seq與其他CLIP技術相比，是研究蛋白質與RNA直接結合的一種有效而強大的技術，它完全提高了鑒定RBP結合位點的能力，大大提高了連接子與RNA之間的連接效率。

eCLIP-Seq技術原理

通過紫外線交聯細胞樣本，導致RNA與其相互作用的蛋白之間形成更穩定的共價交聯，更有助于捕獲瞬時的RNA-蛋白相互作用。將RNA片段與抗RBP抗體共孵育免疫沉淀蛋白質-RNA復合物，純化復合物得到目標RNA進行高通量測序。

簡述流程如下：①細胞收集→②紫外交聯細胞→③裂解超聲處理→④抗體孵育→⑤電泳檢測并轉膜→⑥蛋白酶k消化蛋白，回收RNA→⑦去磷酸化加接頭→⑧反轉錄、PCR擴增→⑨上機測序

eclip-seq原理

CLIP測序技術的比較

云序技術優勢

① eCLIP對RNA文庫制備進行了改進，將環狀連接接頭方式改進為兩步法加接頭，結合高效酶促步驟，使文庫效率提升了數千倍，降低了失敗率和PCR重復。

② 在分子測序中添加Unique Molecular Identifiers（唯一分子標識UMIs），用于PCR重復鑒定，減少測序偏差和PCR擴增的影響，從而提高數據的準確性和可重復性，結果更可信。

③ 提供多種經過驗證的抗體，如METTL3, METTL14, WTAP, RBM15 、FTO, ALKBH5、YTHDC1, YTHDC2, YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, HNRNPA2B1, HNRNP C1/C2和標簽抗體 FLAG、MYC 等供您選擇。

案例解析

案例：抑制 YTHDF2 會引發 MYC 驅動的乳腺癌中的蛋白毒性細胞死亡

題目：Inhibition of YTHDF2 triggers proteotoxic cell death in MYC-driven breast cancer

期刊：Molecular Cell

影響因子：16

研究內容：RNA 結合蛋白 (RBP) 是轉錄后基因表達的關鍵調節因子，異常的 RBP-RNA 相互作用可以促進癌癥進展。在本研究中，作者使用eCLIP-seq測序技術探究YTHDF2作用靶基因，通過CRISPR-Cas9 篩選來探究 RBP 在癌癥中的功能，并鑒定出 57 個在支持 MYC 驅動的致癌途徑中具有獨特作用的 RBP 候選者。作者發現破壞 YTHDF2 依賴性 mRNA 降解會觸發三陰性乳腺癌 (TNBC) 細胞和腫瘤的細胞凋亡。eCLIP 和 m6A MeRIP 測序表明，YTHDF2 與 MAPK 通路中編碼蛋白的 mRNA 相互作用，當 MAPK 通路穩定時，會誘導上皮-間質轉化并提高整體翻譯率。翻譯 mRNA 的 scRibo-STAMP 分析揭示了 YTHDF2 耗盡的實體瘤中單細胞翻譯組的獨特改變，這選擇性地促進了 TNBC 細胞中內質網應激誘導的細胞凋亡。因此，這篇文章通過揭示 YTHDF2 在抵消 MYC 驅動的乳腺癌中 mRNA 合成的整體增加中的關鍵作用，強調了 RBP 的治療潛力。

樣本要求

樣品量：

細胞樣品：2×10⁸

(細胞直徑越小，需要細胞數量越多。如果不好估算則看細胞團塊沉淀 ，一次實驗需要細胞沉淀200-300 μL(一次目標蛋白和陰性對照 IgG）。如果細胞好獲取，為保證實驗成功率，最好以 1.5 至 2 倍細胞量送樣。

組織樣品：1-2g

抗體要求：

提供CHIP 或RIP 抗體，優先選擇已驗證的ChIP級或RIP級抗體 ，一次實驗需 10-15 μg 左右，按抗體說明書條件用干冰或冰袋運輸。

除了常見的細胞、模式生物等，云序生物還可以進行大多數生物樣本的分析，詳情請聯系我們。