技術簡介

RIP(RNA Immunoprecipitation)是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄后調控網絡的有力工具。這種技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。RIP-Seq將RIP技術與高通量測序相結合，能夠高通量地檢測與特定蛋白結合的RNA，從而解析全轉錄組范圍內的目標蛋白-RNA相互作用網絡。

云序優勢

一站式服務：

客戶只需提供細胞，組織或RIP RNA，云序生物為您完成從樣品處理，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。

商業化的RIP試劑盒：

RIP實驗的成敗是決定數據質量的關鍵，云序生物采用商業化RIP試劑盒，保證了RIP實驗的成功率和穩定性。

嚴格的質控：

云序生物在實驗的各個關鍵步驟加入了一系列質控點，全程監控實驗質量，確?？蛻舻玫絻?質的數據。

專業化的生物信息分析：

云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析要求。

樣本要求

樣品類型：

細胞、組織或IP后的RNA。其它類型樣品請詳詢。

樣品量：

a)細胞：5×10⁸

b)組織：500 mg

c)IP后的RNA： >1 μg，OD260/280≥1.8; OD260/230≥1.5 (無明顯降解，電泳檢測樣品特征性條帶完整清晰，無明顯彌散或拖尾 )

樣品運輸及保存：

樣品運輸：樣品置于1.5mL離心f管中，封口膜封好，干冰運輸。

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊液氮凍存后-80℃保存。

數據分析（僅供展示 詳見demo報告）

1、富集峰識別與注釋※

在RIP-Seq中，富集峰代 表了全部活躍轉錄的區域(相對于對照IgG)。利用富集峰的注釋繪制富集峰在不同基因組特征上的比例圖。從總體上查看峰偏向的基因組特征。

2、差異富集區鑒定和注釋

云序生物使用diffReps軟件進行差異富集區(differentially enriched peaks，DEPs)鑒定。默認p-value<0.0001，fold change >=2.0作為差異閾值。(具體以報告為準)。

3、富集峰差異富集區相關基因Go分析

云序生物利用啟動子區(TSS-2000-TSS+2000)差異富集峰對應的基因進行GO功能分析，以注釋并推測這些富集峰(蛋白質)可能參與的功能。 P-value <= 0.05的GO terms被認為是統計明顯的。

4、富集峰/差異富集區相關基因KEGG通路分析

KEGG PATHWAY是將基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學中的分子數據集映射到KEGG通路圖上，以進行這些分子的生物學功能解釋的過程。云序生物利用啟動子區(TSS-2000 ~ TSS+2000)富集峰對應的基因進行通路分析，以注釋并推測這些富集峰(蛋白質)可能參與的通路。以P-value <=0.05作為明顯富集的閾值。

  

5、富集峰可視化

MACS產生了UCSC wig格式的可視化文件。該文件可以上傳到UCSC Genome Browser以在基因組環境中直觀地展示富集峰。云序生物使用50 bp分辨率進行富集峰可視化以供參考。

案例分析

案例1：解析RNA-蛋白相互作用

原文：Genome-wide Identification of Polycomb-Associated RNAs by RIP-seq

期刊：Molecular Cell 影響因子：14.27

Polycomb蛋白在干細胞分化和人類疾病中發揮著重要的作用。近期的研究表明：RNA分子可以作為共作用因子參與Polycomb抑 制蛋白復合物2(PRC2)的形成。本文通過RIP測序在胚胎干細胞中找到了超過9000個與蛋白復合物PRC2相關結合的RNA分子。這些RNA中包括反義轉錄本，基因間轉錄本，基因啟動子相關的轉錄本，以及很多未被注釋的轉錄本。許多轉錄本來源于基因印跡區，ai基因或抑 制基因位點或者是與干細胞相關的bivalent區域。這些結果說明：PRC2蛋白復合物與各類RNA結合，其中一些RNA可以作為人類疾病的分子標志物或是治 療靶點。

??圖1. 與PRC2蛋白復合物結合的RNA分類和統計

案例2：識別miRNA靶基因

原文：Genome-wide identification of translationally inhibitedand degraded miR-155 targets using RNA-interactingprotein-IP

期刊：RNA Biology 影響因子：5.22

miRNA可以通過降解靶mRNA或是抑 制靶mRNA的翻譯發揮調控作用。一個miRNA往往可以調控多個靶mRNA，因此在全基因組范圍內系統性的研究miRNA的靶基因對準確解析miRNA的功能至關重要。僅通過miRNA表達譜和轉錄組分析并不能準確的確定miRNA靶基因。本文在過表達miR-155的HEK293T的細胞中，針對AGO2抗體進行了RIP測序，發現了100多個與AGO2蛋白結合的mRNA，其中有67個被預測為miR-155的靶mRNA。通過整合RIP測序和表達譜數據發現:這些靶mRNA有的通過mRNA降解被調控，有的則是通過翻譯抑 制被調控。

??圖2. 過表達miR-155細胞中明顯變化mRNA的散點圖