m6A等RNA修飾的主要研究手段是通過MeRIP方法對發生修飾的片段進行富集，其后進行高通量測序分析修飾位點。無論是一篇展示修飾位點分布特點的譜學文章，還是深入研究修飾調控基因表達機制的文章，在高通量測序之后，通常都需要對篩選出來的部分修飾位點進行低通量的MeRIP-qPCR驗證。這個實驗簡單卻必不可少，但對于剛剛接觸RNA修飾研究的小伙伴來說，可能對MeRIP-qPCR的方法原理、結果含義及展示方法等還存在一些疑問。在已發表文章中又常常是幾句話帶過，無法解答心中的困惑，回頭面對自己手里的數字，還是一頭霧水。這次我們就在這里詳細談一談MeRIP-qPCR的一些相關問題。

MeRIP-seq實驗流程圖

1、MeRIP-qPCR的目的是什么？

MeRIP-qPCR是驗證某目標基因上的某個修飾位點（以一小段區域的形式，MeRIP法精確不到單堿基）的修飾水平。得到的結果往往是一個%（IP/Input）的數值，它體現的是該位點的修飾水平（可以理解為：這個轉錄本表達了很多條，其中這個位點有修飾的有多少條？）。與普通qPCR驗證基因表達水平的不同，普通PCR一般是驗證基因的表達量（可以理解為：基因轉錄本表達了多少條？）。

2、MeRIP-qPCR的實驗方法？

顧名思義，MeRIP-qPCR就是MeRIP實驗后進行的qPCR實驗。這里的MeRIP實驗同MeRIP-seq測序中MeRIP實驗相同，實驗基本操作也一致：對RNA進行片段化，然后將片段化后的RNA樣品分為二部分：一部分用于免疫共沉淀實驗（IP）后作為IP樣品，另一部分不進行IP直接作為Input樣品。之后再根據實驗目的的不同，對兩部分RNA片段進行逆轉錄和qPCR或者建庫測序。

3、MeRIP-qPCR引物如何設計？

MeRIP-qPCR的目的是對定量修飾位點的表達水平，因此設計的引物不僅要針對目標基因，還要針對基因上發生修飾的位點（區域）。那修飾位點的信息怎么獲得呢？一般有以下幾個途徑：

（1）從MeRIP-seq的測序結果中篩選獲得：

MeRIP-seq報告結果中通常會給出發生甲基化修飾的位置坐標（如云序生物報告中會以chr1:111234-111567的形式給出發生甲基化修飾的區域坐標位置信息）。然后就可以根據位置信息在UCSC genome browser網站（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）獲取這段修飾區域的序列（注意基因組版本的選擇）。

具體操作如下：

在首頁選擇對應的物種及基因組版本后，輸入修飾區域的位點坐標，點擊GO：

確認位置信息正確后，鍵盤按V+D，彈出頁面，點擊get DNA，即可獲得修飾區域的序列信息。保存后進行引物的設計：

（2）通過網站預測獲得：

如果沒有測序結果，想直接通過MeRIP-qPCR驗證關注的某基因上是否存在修飾區域，就只能通過預測得到發生修飾概率高的區域位置，再針對位點設計引物，進行qPCR實驗。網站的預測通常是基于研究公認的該種修飾具有的motif序列等進行預測，在網站輸入目標RNA的序列后，就可生成預測結果。

常用的甲基化預測網站：

m6A RNA甲基化預測網站：http://www.cuilab.cn/sramp/

m5C RNA甲基化預測網站：http://www.rnanut.net/rnam5cfinder/

生成的結果如圖：

4、MeRIP-qPCR結果的計算？

MeRIP-qPCR結果計算公式如下表:

*其中DF和IF是稀釋倍數。如最初用于IP和Input的RNA的比例為a：b，則在計算%(IP/Input)值時，需要乘以稀釋倍數b/a（經過IP實驗得到的RNA量一定少于不做IP實驗的Input的RNA量，且逆轉錄+qPCR的使用的IP和Input的模板量也不同，因此要在計算的時候將差異倍數考慮進去）。一般用于逆轉錄的Input RNA量為1 μg，則DF=1/（用于IP的RNA的量）。

*P值的計算需要有重復值才能計算。

示例：

只看公式可能不夠直觀，那就舉個例子來詳細講解一下。

例如，實驗組和對照組片段化后的總RNA均為21 μg。分別取其中的20 μg的RNA用于IP實驗，剩下1 μg的RNA用做Input樣品。對IP后的RNA樣品及Input RNA進行逆轉錄（由于IP后RNA樣品量較少，建議不測濃度，直接全部用于逆轉錄）。得到以下Ct值后進行下一步計算：

(1)計算稀釋倍數：即DF=1/（用于IP的RNA的量）=1/20；

(2)計算%(IP/Input)：%(IP/Input)=2^(B1-A1)*DF*100

實驗組%(IP/Input)=2^{(23.00-23.50)}*（1/20）*100=3.536，%（IgG/Input）=2^{(23.00-40.00)}*（1/20）*100=0.000038547；

對照組%(IP/Input)=2^{(20.73-22.03)}*（1/20）*100=2.031，%（IgG/Input）=2^{(20.73-40.00)}*（1/20）*100=0.000007909；

（在excel中可以使用公式=POWER(2,Input-IP/IgG)*1/20*100進行計算）

(3)計算Fold enrichment：Fold enrichment=%(IP/Input)/%(IgG/Input)

即實驗組Fold enrichment=92681.90，對照組Fold enrichment=256749.15；

(4)計算實驗組/對照組：實驗組Fold enrichment/對照組Fold enrichment=0.36098。

最終計算結果如下表所示：

5、IP/Input/IgG傻傻分不清：我需要做哪些、如何展示？
前兩個環節談到過，IP是用該修飾的特異性抗體，通過免疫共沉淀富集帶修飾的片段，Input是不進行富集的所有片段，這兩個是MeRIP-qPCR必做的，每個樣品分別做了這兩部分的PCR結果合起來計算才能體現修飾水平，達到實驗的目的。而IgG是用非特異性抗體，通過免疫共沉淀富集非特異性結合的片段，可作為對IP的對照，證明IP的信號不是源自抗體非特異性結合，而確實是針對發生修飾的片段（IgG可以選做）。

MeRIP-qPCR結果通常用柱狀圖展示即可，常見的如以下3種情況：

（1）只做IP和Input：展示%（IP/Input）值

如果有兩組樣品，展示一個目的基因在兩組間的修飾水平?；蛘咭唤M樣品，展示多個基因的修飾水平差異，可以只做IP和Input，展示%（IP/Input）值[1, 2]。

*為了便于直觀體現組間的比較，有時會將所有%（IP/Input）數值統一除以某組樣品或某個基因的%（IP/Input）數值，使柱狀圖中該組樣品或該基因的柱高變為1，相當于全部以某組樣品或某個基因為基準展示相對修飾水平。經這種處理后通?？v坐標會稱為relative enrichment、relative level[3, 4]。

（2）做IP、IgG和Input：展示%（IP/Input）值、%（IgG/Input）值

如果為了嚴謹的證明實驗體系沒有問題，或者驗證指標只有一個分組/一個基因但需要一個對照，可以同時多做一個IgG，在結果展示%（IP/Input）和%（IgG/Input）兩個柱子對照[5, 6]。

（3）做IP、IgG和Input：展示Fold enrichment值（%（IP/Input）和%（IgG/Input）的比值）

如果做了IgG對照，還可以選擇用Fold Enrichment來展示，富集倍數%(IP/Input)/%( IgG/Input)，即IP比對照的IgG信號高多少倍，也可以用來體現修飾的水平。通常是分組和基因都是多個時不想一一單獨展示IgG[7]。

相信通過上面的學習，你已經基本掌握MeRIP-qPCR這項技能啦！但由于與普通PCR存在很多異同，可能你還是會存在一些疑問。放心！云序生物這就給你解答！

6、MeRIP-qPCR為什么沒有內參基因？

（1）MeRIP-qPCR不需要內參來進行樣本間的均一化矯正

傳統的RT-qPCR中，每個樣本都要做一個內參基因，如哺乳動物會選擇GAPDH，而miRNA則會選擇U6。那么是不是m6A-IP-qPCR 就真的沒內參了呢？其實也不是！實際上我們會發現整個input充當了內參基因的概念，一個基因的甲基化水平是無法直接用RIP下來的RNA在做qPCR后直接用Ct值高低來衡量的，需要input中的RNA作為背景。而IgG抗體的加入則是為了排除m6A抗體非特異性結合情況發生。由于有時候m6A抗體不同廠家、保質期、蛋白性能等因素可能會產生非特異性結合的結果，這時候就需要用IgG來排除這部分的干擾。目前市面上使用的絕大部分m6A抗體為兔抗，那么盡量在使用IgG做對照時也使用兔抗來源的IgG。

另外，從結果的形式%（IP/Input）也可以看出，MeRIP-qPCR實驗側重看修飾的片段（IP樣品qPCR結果）占總片段（Input樣品qPCR結果）的比例，實驗目的只是要得到這兩者的比值就體現修飾水平，因此MeRIP-qPCR不需要內參。

例如：針對目的基因目的位點qPCR，樣品A的IP結果0.2，Input結果1；樣品B的IP結果0.3，Input結果1.5，得到的%（IP/Input）結果顯示兩個樣品甲基化水平數值都是0.2，修飾水平無差異，到此就達到了目的。

（2）沒有公認在不同樣品中修飾水平都會穩定的基因可做參照
前面第1點主要從多個樣品比較的角度解釋了MeRIP-qPCR為何不需要內參基因。而有時也會出現以下情況：1）沒有分組對比，只想看下這一個（組）樣品中該基因有沒有修飾：結果的%（IP/Input）達到多少可算作有修飾？2）想看看MeRIP實驗體系有沒有問題，想做個已知有修飾的基因當陽性對照看看效果。

針對這兩種情況，回答是目前沒有一個定值，也沒有一個穩定修飾的基因可以做參考。但針對第一種情況，可以在進行實驗時，同時做一個非特異性IgG抗體的免疫沉淀富集，對比樣品本身的IP和IgG是否有顯著差異，放在文章中也可作為該位點有一定程度的修飾的證據。RNA修飾是一個動態可逆的酶促反應，在相同組織細胞中的水平可能都會隨著環境千變萬化，不同組織中更是差別很大。與普通qPCR檢測基因表達時能找到穩定表達的看家基因不同，MeRIP-qPCR沒有一個穩定修飾的基因做參照，目前RNA修飾文章也不要求有這種參照。不過也可做IgG對照檢測體系的特異性。

因此，在云序生物的GenSeq m6A MeRIP試劑盒中，我們貼心的為客戶提供了IgG抗體以及m6A的一對陽參引物和一對陰參引物（根據文獻報道：靶向 HEK293 細胞中 m6A 修飾的某段 RNA 區域（Positive Primers）和無 m6A 修飾的某段 RNA 區域（Negative Primers）），供有條件且感興趣的用戶驗證實驗效率和抗體特異性。但如前面所說，m6A修飾具有很強的細胞類型特異性，無法保證在任何細胞系或樣品中，該引物都能作為很好的參照。因此，建議想對實驗體系進行進一步自驗證的用戶，采用HEK293細胞的RNA進行驗證實驗。

7、MeRIP-qPCR不能看出基因表達量？

可能有人會想：Input樣品又沒經過IP，qPCR操作不就與普通qPCR沒什么差別，那么做了MeRIP-qPCR，不能得到基因表達量的結果嗎？比如前面MeRIP-qPCR例子中A和B樣品Input分別是1和1.5的結果可以用來看一下這個基因在兩樣品中的表達量有沒有差異？——我們不知道，因為沒有內參基因來計算，要看表達量的話就不知道1和1.5的差異是否是如前一段那樣由于用量差異等因素帶來的了。因此通常說起MeRIP-qPCR，結果不能用來體現基因表達量。

那如果在MeRIP-qPCR步驟中直接多擴增一個內參基因，與目的基因Input聯合在一起定量表達量是否可行？我們只能說可以參考，不過由于MeRIP實驗是有片段化這一步驟的，PCR信號會弱一些，對于驗證表達量的目的來說還是推薦采用常規的qPCR步驟會更準確、風險更小。

*以上圖參考文獻：
【1】 Liu, L. , Wang, J. , Sun, G. , Wu, Q. , & Pan, Q. . (2019). M6a mrna methylation regulates ctnnb1 to promote the proliferation of hepatoblastoma. Molecular Cancer, 18(1).

【2】Tong, J. , ?Wang, X. , ?Liu, Y. , ?Ren, X. , ?Wang, A. , & ?Chen, Z. , et al. Pooled crispr screening identifies m 6 a as a positive regulator of macrophage activation. Science advances, 7(18), eabd4742.

【3】Yin, H. , ?Zhang, X. , ?Yang, P. , ?Zhang, X. , & ?Zhang, R. . (2021). Rna m6a methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming. Nature Communications, 12(1).

【4】Yang, X. , ?Shao, F. , ?D ?Guo, ?Wang, W. , & ?Lu, Z. . (2021). Wnt/β-catenin-suppressed fto expression increases m6a of c-myc mrna to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis. Cell Death & Disease, 12(5).

【5】Wang, W. , ?Shao, F. , ?Yang, X. , ?Wang, J. , & ?Lu, Z. . (2021). METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding. Nature Communications.

【6】Chen, C. , ?Liu, W. , ?Guo, J. , ?Y ?Liu, & ?Gao, S. . (2021). Nuclear m6a reader ythdc1 regulates the scaffold function of line1 rna in mouse escs and early embryos. Protein & Cell(7849).

【7】Zhou, B. , ?Liu, C. , ?Xu, L. , ?Yuan, Y. , & ?Ma, X. . (2020). N 6 -methyladenosine reader protein ythdc2 suppresses liver steatosis via regulation of mrna stability of lipogenic genes. Hepatology.