BID-Seq：假尿嘧啶修飾測序技術

假尿嘧啶修飾（Pseudouridine, Ψ）是最早發現并且豐度最高的 RNA 修飾，它廣泛分布于 rRNA，tRNA，snRNA 和 snoRNA上，并且在不同物種之間高度保守。Ψ修飾由假尿苷合酶（PUS）催化尿嘧啶發生異構化而形成，在哺乳動物 mRNA 上，定量質譜顯示Ψ的含量僅次于 m6A 修飾。近些年研究發現，Ψ參與穩定性、翻譯、剪接、蛋白質-RNA 相互作用等過程，可以影響不同生物學功能。作為哺乳動物mRNA上豐度第二高的修飾，Ψ在RNA中是否發揮著重要的調控功能目前尚不完全清楚。由于無法在單堿基分辨率下全面、定量地檢測Ψ，其生物學功能的進一步研究受到了阻礙。

技術簡介

云序生物針對RNA假尿嘧啶修飾采取的是BS誘導的缺失測序法（BID-seq），可同時對Ψ修飾進行高通量檢測和單堿基定位。BID-seq技術可以在不影響胞苷的情況下，將Ψ定量地轉化為“Ψ-BS加合物”，導致逆轉錄后在含有Ψ位點處出現堿基缺失信號。建庫測序后再根據檢測標準進行數據處理和分析，最終實現單堿基分辨率下對RNA上Ψ修飾的定量測序，BID-seq技術將有助于研究RNA上Ψ修飾在諸多生理或病理過程中的位點分布、修飾化程度動態變化、生物學功能等。

BID-seq方法主要包括以下四個步驟：

（1）RNA片段化，加接頭

（2）BS處理，將Ψ修飾完全轉化為Ψ-BS加合物

（3）構建RNA文庫并測序

（4）生物信息學分析，鑒定修飾位點

 BID-Seq測序建庫流程圖

云序優勢

（1）單堿基分辨：

與傳統的CeU-seq等方法不同，BID-seq能夠將Ψ修飾完全轉化為Ψ-BS復合物，使反轉錄酶在反轉錄過程中在Ψ-BS復合物位點處跳躍讀取下一位堿基，構成在Ψ-BS位點處的堿基缺失信號，從而實現了Ψ修飾的單堿基分辨率測序。

（2）保留RNA片段復雜性：

與傳統的bisulfite反應不同，BID-seq的化學反應條件只針對于Ψ修飾，并不產生任何C到U的轉化，完全保留了RNA片段在測序中的序列復雜度。

（3）一站式服務：

客戶只需提供細胞、組織、體液或總RNA，云序生物為您完成從樣品準備，文庫制備，上機測序到數據分析的整套服務流程。

（4）專業的生物信息學分析：

云序生物擁有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析需求。

樣本要求

樣品類型 

全血、細胞、組織或RNA，其他樣本類型可電話咨詢。 

樣品量

a) 全血：> 2 ml (推薦用EDTA 抗凝采血管，不可用肝素抗凝管)

b) 細胞：>5×10⁶ 

c) 組織：100 mg

d) 總RNA：>10 μg (OD260/280：1.6-2.3; RNA無明顯降解) 

樣品運輸及保存

樣品運輸：樣品置于1.5mL離心管中，封口膜封好，干冰運輸。 

樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護劑處理，液氮凍存后-80℃保存；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復凍融。

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案例解析

案例：BID-seq定量測序法揭示哺乳動物mRNA中存在豐富的假尿苷

原文：Quantitative sequencing using BID-seq uncovers abundant pseudouridines in mammalian mRNA at base resolution

期刊：Nature Biotechnology  影響因子：47

美國芝加哥大學何川教授團隊提出并開發了對mRNA上Ψ修飾進行單堿基分辨率、定量測序的測序方法，簡稱BID-seq。BID-seq以高精度測序譜圖揭示了在人類細胞系和動物組織的mRNA上數以千計的顯著性Ψ位點（>10%修飾化程度，modification fraction），以及大量的高修飾Ψ位點（>50%修飾化程度）。

本研究中用10-20 ng的RNA 就能在多個人類細胞系和 12 種不同的小鼠組織中檢測到豐富的Ψ位點，并提供其化學計量信息。該研究進一步鑒定了mRNA上Ψ修飾的“writer”蛋白，發現高修飾Ψ位點對mRNA代謝的影響，并證明哺乳動物mRNA的終止密碼子上存在天然存在的Ψ修飾。BID-seq（云序生物可提供）為研究mRNA上Ψ修飾在諸多生理或病理過程中的位點分布、修飾化程度動態變化、生物學功能等，奠定了技術基礎，攻克了Ψ定量測序技術瓶頸，將引領RNA表觀轉錄組領域步入新的階段。

 圖1 BID-seq以單堿基分辨率檢測人類mRNA中的Ψ位點，以及對單個Ψ位點修飾酶的表征

圖2 小鼠組織mRNA中含有大量的Ψ修飾

圖3 Ψ影響mRNA的穩定性

圖4 Ψ修飾促進體內終止密碼子通讀