二甲雙胍抑ai機制研究！云序生物客戶 Nature子刊文章

上海交通大學附屬第一人民醫院張箴波團隊以題為“Metformin sensitizes endometrial cancer cells to chemotherapy through IDH1-induced Nrf2 expression via an epigenetic mechanism”發表于Nature子刊《Oncogene》（影響因子：6.854）。該研究，揭示了“神藥”二甲雙胍抑 制子宮內膜ai的新機制，指出了DNA羥甲基化修飾在此過程中起的關鍵作用。

研究背景：

二甲雙胍，因其降糖能力強，副作用小，是糖尿病患者主要的控糖藥物。隨著研究的深入，二甲雙胍其他的生物學功能也逐漸被發現，相關研究在Nature、Cell、Cell Stem Cell等期刊上頻頻亮相，主要包括：抑ai、降血脂、降 血壓、改善脂肪肝、改善多卵巢綜合癥、減脂、延長壽命和預防老年癡呆癥等等等等??！所以，被人們冠以“神藥”的稱號。

DNA羥甲基化被稱為哺乳動物DNA中的“第六堿基”，與ai癥、神經退行性疾病等人類重大疾病密切相關，是表觀遺傳學領域的新熱點。本篇文章的作者在子宮內膜ai細胞中檢測到DNA羥甲基化修飾（本文DNA羥甲基化相關服務，由云序生物提供），并證實這種修飾可促進ai細胞的增殖。隨后，作者用“神藥”及其他抗ai藥物處理增殖的ai細胞后發現增殖過程被抑 制。

那作者具體是怎么做的？讓我們詳細看看。

研究樣本：

人類細胞系：子宮內膜ai細胞系（Ishikawa，HEC-1A，SPEC2，HEC-1B，AN3CA，ECC-1）、正常子宮內膜細胞系。

人類組織：子宮內膜ai組織200例（未分期樣本160例；分期樣本40例：G1期25例，G2期8例，G3期7例）、增生期子宮內膜組織10例。

研究結果：

1.IDH1在子宮內膜ai組織及ai變細胞系中高表達

作者通過免疫組化，發現IDH1基因在ai變的子宮內膜中的陽性染色率明顯高于增生期子宮內膜組織（圖1A，B）。為保證結果準確，作者將樣本擴大至每組35人，應用ELISA法檢測血漿中IDH1的表達量，同樣證實ai變患者血清中IDH1高表達（圖1C）。

那么，IDH1基因在細胞中的表達情況是怎樣的呢？通過檢測8種子宮內膜ai細胞系（圖1D），在mRNA和蛋白水平上，檢測到IDH1基因在Ishikawa，Spec2，HEC-1A和HEC-1B細胞系中高表達。綜上，IDH1在子宮內膜ai組織和ai變細胞系中高表達。

圖1. IDH1在組織和細胞系中的表達情況

2.二甲雙胍通過抑 制IDH1表達提高子宮內膜ai細胞對化療的敏感性

作者以IDH1基因表達top 3的細胞系為材料，檢測不同二甲雙胍用量和反應時間內IDH1的表達量，結果證實二甲雙胍可抑 制IDH1表達（圖2A，B）。另外，細胞增殖和計數實驗證實二甲雙胍與抗ai藥物可協同抑 制ai細胞增殖（圖2C，D）?？蒊DH1是否參與上述ai細胞增殖過程呢？作者通過體外干擾實驗，成功抑 制IDH1基因表達（圖2E），并檢測到干擾細胞在分別處理兩種抗ai藥物后的增殖能力比對照組低（圖2F）。

圖2.二甲雙胍抑 制IDH1表達并提高ai細胞對化療的敏感度

3.ɑ-KG提高二甲雙胍對化療的敏感度

ɑ-KG是IDH1酶的產物之一，在本研究中，作者用二甲雙胍處理子宮內膜ai細胞，發現ɑ-KG的表達與二甲雙胍的反應時間和劑量成反比（圖3 A，B）。ɑ-KG在過表達IDH1基因的細胞系中高表達，而二甲雙胍處理后，ɑ-KG表達量受抑 制，說明二甲雙胍通過抑 制IDH1基因表達，從而抑 制ɑ-KG表達（圖3C）。并與抗ai藥共用后，能有效抑 制細胞增殖（圖3D）。

圖3. α-KG參與二甲雙胍調控化療敏感性

4.二甲雙胍通過TET1羥甲基化調控IDH1-α-KG信號通路促進抗ai藥的藥效

TET1作為一種依賴α-KG的加氧酶，能夠促進5-甲基化胞嘧啶轉為5-羥甲基胞嘧啶，IDH1作為α-KG的前體，與TET結合的功能研究還不清楚。所以，作者過表達IDH1后，檢測到TET1的mRNA與蛋白含量上調（圖4A，B），且α-KG表達量也上升了（圖4C）。通過免疫熒光實驗，觀測到IDH1或TET1基因可提高細胞內羥甲基化水平，而二甲雙胍處理或敲低處理后，羥甲基化水平受抑 制（圖4D），并且TET1與二甲雙胍的劑量和反應時間一致（圖4E）。Dot blot實驗（圖4F）再次證實IDH1過表達細胞羥甲基化水平可被二甲雙胍抑 制。并通過細胞增殖實驗，檢測過表達TET1后，ai細胞增殖量略有提高，但化療藥物對細胞增殖影響不大（圖4G）。

圖4. TET1參與二甲雙胍促進子宮內膜ai細胞的敏感性

5. Nrf2羥甲基化水平的降低影響二甲雙胍引起的化療敏感性

Nrf2與IDH1在子宮內膜ai組織的分布和發病時期一致（圖5A，B），且Nrf2可與TET1結合（圖5C）。已知TET1影響羥甲基化水平（圖4D），那Nrf2能否影響羥甲基化水平呢？作者通過Dot blot實驗，證實Nrf2基因的羥甲基化離不開TET基因調控（圖5D）。二甲雙胍處理細胞中Nrf2、TET1等基因在蛋白水平的表達下降（圖5E），且Nrf2啟動子區域上羥甲基化水平下降了（圖5F，G），說明Nrf2發生羥甲基化的作用區域可能在啟動子上。過表達keap1基因（與Nrf2基因作用相反）后，細胞增殖活性高于對照組（圖5H），說明Nrf2基因對細胞增殖起抑 制作用。綜上，二甲雙胍通過影響TET1基因，降低Nrf2啟動子區DNA羥甲基化修飾，從而提高對化療藥物的敏感度。

圖5.二甲雙胍通過降低Nrf2的羥甲基化調控ai細胞對化療藥物的敏感性

6. Nrf2基因通過正向反饋加強IDH1信號通路

上文可知，二甲雙胍能夠抑 制Nrf2和相關基因的表達。因此，作者想看看影響Nrf2基因表達后，相關基因的變化趨勢，結果發現兩者表達趨勢是一致的（圖6A-D）。且抑 制Nrf2基因后，促進了ɑ-KG表達（圖6E，F），即Nrf2基因調控了IDH1-ɑ-KG-TET1-Nrf2信號通路。隨后，作者對IDH1啟動子區序列進行結構預測，發現該區域與NF2結合位點有6個抗氧化反應元件（ARE）（圖6G），并發現其中一個報告基因與Nrf2結合明顯。以上結果表明，Nrf2通過影響IDH1轉錄，調控IDH1-ɑ-KG-TET1-Nrf2信號通路。

圖6. Nrf2基因通過正向反饋加強IDH1信號通路

小結：

這篇文章干貨滿滿，不但揭示了二甲雙胍參與IDH1-ɑ-KG-TET1-Nrf2通路，從而抑 制子宮內膜ai發展，還證實了TET1與Nrf2共同影響DNA羥甲基化水平，為今后研究子宮內膜ai對化療藥物的耐藥性提供理論依據。

全文信息：

Bai M, Yang L, Liao H, et al. Metformin sensitizes endometrial cancer cells to chemotherapy through IDH1-induced Nrf2 expression via an epigenetic mechanism. Oncogene(2018).

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