云序客戶12分文章，教你如何巧用RIP測序玩轉分子機制！

作為環狀RNA和RNA甲基化領域的**，云序生物近一個月捷報頻傳。RNA甲基化領域，云序m6ARNA甲基化測序服務協助上海交大余健秀組發表18年國內**10分以上RNA甲基化文章（“Nucleic Acid Research”，IF:10.162)；環狀RNA領域，云序環狀RNA測序服務助力多篇****，包括：****小鼠大腦創傷外泌體環狀RNA研究，****非洲爪蟾環狀RNA研究，****紅斑狼瘡性腎炎環狀RNA研究(Cell子刊，IF:17.906)。

近日，又一個云序產品：RIP測序（RIP-Seq）助力華西醫學院發表12分期刊。四川大學周圣濤團隊巧用RIP測序解析RNA結合蛋白SORBS2在卵巢ai細胞轉移中的作用機制，為卵巢ai的靶向治 療提供了重要依據，課題思路新穎﹑非常具有借鑒性。

研究背景：

卵巢ai是一種致死率很高的婦科惡性腫 瘤。由于介導該疾病發生 發展的分子機制還未被清楚闡釋，針對該疾病的治 療和診斷效果一直不理想。此外，基于RBP （RNA binding protein，RNA結合蛋白）的mRNA 轉錄后調控是否與卵巢ai以及免疫功能相關仍不確定。文章通過現有數據庫（cBioPortal TCGA，AOCS等）明確SORBS2 (Sorbin and SH3 domain containing 2) 作為卵巢ai轉移抑 制的關鍵分子并且SORBS2的表達量與卵巢ai病人的預后相關，SORBS2敲減實驗證明該分子主要影響卵巢ai細胞的轉移而不會明顯改變增殖信號通路。RIP測序（云序生物提供）聯合全轉錄組測序的相關生物信息學分析提示SORBS2結合并穩定部分轉錄本，其中WFDC1和IL-17D作為SORBS2結合的重要靶點可以抑 制卵巢ai細胞的轉移灶的定殖。

研究思路：

作者通過對編碼RBP的基因進行了兩次基于數據庫的篩選打分將與卵巢ai相關的關鍵分子鎖定至SORBS2。 為了尋找SORBS2的潛在下游靶點，RIP-Seq 將SORBS2-RNA復合物免疫富集，對SORBS2結合的RNA進行測序，高通量分子測序結果給出了和SORBS2結合的RNA分子。此外，轉錄本穩定性實驗（Transcript Stability Assays）對SORBS2敲減細胞系中的轉錄本半衰期進行計算從而得到因為SORBS2敲減穩定性下降的轉錄本。比較SORBS2結合的轉錄本（來自RIP-Seq）數據集和轉錄本穩定性數據集（全轉錄組穩定性分析），被SORBS2直接結合的轉錄本在SORBS2敲減后穩定性下降的轉錄本**中有明顯富集。該結果證明在卵巢ai當中，SORBS2可以通過與轉錄本直接結合從而使轉錄本更加穩定。SORBS2結合的轉錄本當中，91個（8.38%）作為卵巢ai轉移SORBS2下游的潛在靶點。根據這些潛在靶點是否表達分泌蛋白進一步把范圍縮小至7個基因，經過臨床樣本分析、回補實驗和其他分子生物學實驗以及動物實驗驗證，由SORBS2直接結合的WFDC1和IL-17D在SORBS2敲減后下降，并且這兩個基因可以抑 制卵巢ai細胞轉移灶定殖。后續工作還明確了SORBS2識別并且穩定這些具有ai細胞轉移抑 制作用轉錄本的作用域ZnF_C2H2，SORBS2敲減介導的分泌蛋白質組改變和單核細胞（monocyte）到骨髓衍生抑 制細胞（MDSCs）和M2樣巨噬細胞極化相關。

研究一：從數據庫中篩選確定SORBS2

基于RBP對于mRNA的轉錄后調控是否與卵巢ai細胞轉移以及免疫功能相關還不清 除，如何建立RBP和該疾病的聯系是首先需要回答的問題?；谌齻€原則和已經發表的文獻對1345個RBP編碼蛋白進行打分，三個打分條件分別是 ：1）腫 瘤組織中的表達量低于正常組織；2）轉移灶處表達量比原發處表達量低；3）與干細胞狀態呈負相關。初篩將范圍縮小至145 RBP基因。根據TCGA數庫中這些基因的擴增（amplification）和刪減（deletion）情況，確定其中四個BTF3、SORBS2、CIBRP和MEX3D可能與卵巢ai相關的基因。Transwell實驗和siRNA實驗證明SORBS2和MEX3D敲減可以增強卵巢ai細胞的轉移灶定殖能力。結合AOCS數據庫預測值，TCGA數據庫的GSEA分析結果（TGF-beta和細胞黏附）均進一步證明SORBS2是抑 制卵巢ai轉移的關鍵RBP。臨床樣本信息庫（CSIOVDB、West China cohort of ovarian cancer）同樣證明SORBS2與卵巢ai病人的治 療效果相關，臨床分級越高，ai細胞分化程度越高且病人預后越差時，SORBS2表達下調越明顯。同時分子實驗證明，在卵巢ai細胞系中沉默SORBS2在體內體外均增強卵巢ai細胞的轉移，但不影響這些細胞的增值和生長速率。

研究二：高通量測序結果鎖定WFDC1和IL-17D

既然SORBS2的細胞表型與功能都已確定，那么這一重要的RBP如何在卵巢ai細胞中發揮作用？哪些SORBS2靶標比較關鍵？云序生物RIP測序結果給出SORBS2直接結合的靶點，聯合全轉錄組范圍RNA穩定性實驗以及全轉錄組測序結果證明SORBS2可以與部分轉錄本結合并使他們更加穩定，其中91個基因被鎖定。功能分析（GO分析和KEGG通路分析）表明這些基因發揮著絲粒組裝等生物學功能并富集于FoxO等信號通路。這91個基因中*7個基因可以編碼分泌蛋白，其中WFDC1和IL-17D在SORBS2敲減后穩定性降低。分子實驗證明無論過表達或者沉默SORBS2，WFDC1和IL-17D穩定性相對應的增強或減弱。SOSRBS2調節兩者穩定性的方式是結合3’UTR區域而不改變3’UTR的長度。明確SORBS2與WFDC1和IL-17D的聯系之后，這種結合并穩定的關系在卵巢ai細胞中發揮怎樣的生物學功能？臨床信息顯示，SORBS2表達量低的病人樣本中WFDC1和IL-17D的表達量也相對較低。無論動物實驗（測轉移結節）還是細胞實驗（Transwell侵襲模型），回補過表達WFDC1或者IL-17D都能抑 制卵巢ai細胞的轉移能力或侵襲能力。

研究三：結合功能域和免疫調節

SORBS2主要含有三種結構域，SoHo、ZnF_C2H2以及SH3, 三個突變實驗分別對應突變一個結構域。卵巢ai細胞轉染實驗以及動物實驗發現ZnF_C2H2是SORBS2結合并穩定轉錄本時所必須的功能結構域。既然WFDC1和IL-17D都是SORBS2低表達ai癥細胞的分泌因子，那么它們是否對卵巢ai細胞轉移的腫 瘤微環境有影響？實驗證明SORBS2敲減介導分泌蛋白改變與單核細胞、MDSC和M2型巨噬細胞極化相關，SORBS2在腫 瘤微環境中有穩定轉錄本和免疫調節作用。源于ai癥的SORBS2穩定的分泌蛋白體可以有效地抑 制卵巢ai轉移并調節體內腫 瘤促進性骨髓細胞的積聚。

結語：

文章揭示了RNA結合蛋白SORBS2在卵巢ai腫 瘤細胞轉移過程中的重要生物學作用，從數據庫搜索到通過RIP-seq鎖定SORBS2靶基因，相關結果提出了一個全新的連接ai癥發展和免疫調節的轉錄后調控網絡，這一網絡依賴于SORBS2結合并穩定轉錄本的重要生物學作用。

原文：

The RNA binding protein SORBS2 suppresses metastatic colonization of ovarian cancer by stabilizing tumorsuppressive immunomodulatory transcript Genome Biol, 2018, DOI: 10.1186/s13059-018-1412-6.

作者簡介：

周圣濤教授，四川大學華西第二醫院黨委委 員、婦產科副主任醫師。團隊主要圍繞卵巢ai等婦科惡性腫 瘤發生 發展分子機制領域開展系統研究，在蛋白質組學及RNA領域和腫 瘤微環境調控ai細胞可塑性與腫 瘤轉移領域取得了系統性的創新成果，其中包括在Genome Biology、PNAS、Cancer Research、Oncogene、Mass Spectrometry Reviews、Molecular & Cellular Proteomics等雜志發表的論文。

云序相關推薦：

RIP測序

環狀RNA測序

全轉錄組測序

RNA pulldown

m6A RNA甲基化測序

m5C RNA甲基化測序

上海云序生物科技有限公司

Shanghai Cloud-seq Biotech Co.,Ltd

地址：上海市松江區莘磚公路518號20號樓3樓

電話：021-64878766

網站：www.cccppp1.com

郵箱：market01@cloud-seq.com.cn