再添新喜！云序客戶發表****非洲爪蟾環狀RNA研究成果！

作為新的明星分子，環狀RNA的熱度與日俱增。環狀RNA到底火到了什么程度？從云序客戶捷報頻傳﹑研究成果不斷就可見一斑：上期我們剛剛介紹云序客戶發表了小鼠腦創傷模型外泌體環狀RNA的研究，整合了外泌體和環狀RNA兩大科研熱點。在探索新物種的環狀RNA研究上，云序客戶此前更是先后發表了全世界首篇斑馬魚環狀RNA、**篇小麥環狀RNA和**篇雞環狀RNA文章，如今首篇非洲爪蟾的環狀RNA文章新鮮出爐了！這一成果今年年初發表在《Chemosphere》（影響因子8.943）上！

研究背景：

利用高通量測序手段，研究者們在擬南芥、小鼠、果蠅和人體內都發現了環狀RNA的高度表達，證明了環狀RNA在不同物種中存在。目前，已經進行過環狀RNA研究的物種數量還非常有限，環狀RNA數據庫circBase中已收錄的物種*有7個。作為一種重要的模式生物，非洲爪蟾的環狀RNA尚未見報道。本文通過云序生物提供的一站式環狀RNA測序、環狀RNA定量PCR、環狀RNA的RNase R耐受性實驗和生物信息學服務于全世界進行了非洲爪蟾環狀RNA表達譜的構建，為后續研究脊椎動物環狀RNA的生物學功能奠定了基礎，非常具有借鑒意義。

研究思路：

作者首先分離了采用除草劑處理的雄性非洲爪蟾的睪丸組織，提取RNA，通過全轉錄組測序檢測樣本中環狀RNA的表達變化。結果發現405個差異表達的環狀RNA，其中44條上調和361條下調，這暗示著這些環狀RNA可能在AZ污染過程中發揮作用。接下來通過環狀RNA定量PCR檢測和RNase R耐受性實驗驗證了環狀RNA的表達量和結構。隨后通過生信分析如GO及KEGG分析對差異表達的環狀RNA進行了功能預測。GO分析表明這些RNA分子主要參與19條信號通路，其中Wnt信號通路和黃體酮介導的卵母細胞成熟通路可能是AZ污染涉及的信號通路。CircRNA-miRNA互作網絡圖揭示了環狀RNA作用靶miRNA及可能的功能。本文研究了非洲爪蟾的環狀RNA表達譜，為后續分子機理詳細研究提供諸多靶分子。

研究路線圖：

1.環狀RNA測序，高通量篩選AZ處理相關環狀RNA

各類農藥(除草劑、殺蟲劑和殺菌劑三類)對非洲爪蟾產生的包括神經發育、性腺發育和**發育等方面的毒 害作用,使得非洲爪蟾作為農藥污染監測的模式生物備受青睞。莠去津（Atrazine, AZ）是地下水和地表水中常見的環境內分泌干擾物之一。研究人員在Nieuwkoop-Faber（NF）第47階段（孵化后第13天），將來自一對成年配偶的蝌蚪隨機分為AZ處理和對照兩組，隨后收集雄性非洲爪蟾的睪丸組織（AZ處理組vs.對照組：3 vs.3）用于檢測非洲爪蟾中環狀RNA的表達情況，檢測一共發現了68575條環狀RNA。接下來，研究人員系統分析了不同樣本之間環狀RNA的表達情況，發現405條環狀RNA差異表達（包括44條上調和361條下調），這暗示著這些環狀RNA可能在AZ污染過程中發揮作用。

圖注：不同樣本之間差異表達的環狀RNA

2. 環狀RNA定量PCR及RNase R耐受實驗，驗證環狀RNA的表達和結構

為了驗證測序結果的準確性，研究人員隨機選取了8條差異表達的環狀RNA，利用“divergent primers”進行環狀RNA定量PCR檢測和RNase R耐受性實驗。環狀RNA的表達都能夠被定量PCR實驗檢測到，并且定量PCR結果與測序結果趨勢一致，表明環狀RNA測序結果準確性非常高。環狀RNA都能抵抗RNase R的消化，進一步證實了這些RNA的環形結構。

圖注：差異表達環狀RNA的定量PCR驗證。上：引物位置圖；下：RNase R耐受性實驗結果

3.生物信息學分析，AZ處理相關環狀RNA的功能預測

2013年兩篇Nature文章揭示環狀RNA具有miRNA海綿的功能，它可以吸附miRNA來調節相關基因的表達。此后，環狀RNA的ceRNA功能機制正被人們研究。研究人員通過生物信息學預測，發現282條AZ相關差異表達的環狀RNA含有miRNA的結合位點，每個環狀RNA的結合位點數從1到21不等?；谶@些數據，研究人員根據它們的結合能力選出了5個miRNA。 然后他們隨機選擇了5個差異下調的環狀RNA，并使用前5個預測的miRNA構建了circRNA-miRNA網絡?？梢钥闯雒總€環狀RNA有多個miRNA結合位點，且一些環狀RNA與同一miRNA的結合位點是相同的，暗示著環狀RNA彼此之間的競爭性與miRNA結合。以上結果表明非洲爪蟾體內環狀RNA可能存在的miRNA的海綿功能。

圖注：依據AZ處理組5條差異下調的環狀RNA建立的circRNA-miRNA網絡圖

此外研究人員在以上基礎上進一步預測了這282條差異表達的環狀RNA結合miRNA的靶基因功能。通過GO分析和KEGG 信號通路分析，發現這些miRNA的靶基因主要參與了19條信號通路，其中Wnt信號通路和黃體酮介導的卵母細胞成熟通路可能是AZ污染涉及的信號通路。

圖注：差異表達的環狀RNA來源基因KEGG分析

結語： 

作為一種存在于各類真核生物中的新型非編碼RNA，環狀RNA逐漸成為了當下熱門的明星分子。由于環狀RNA的研究剛剛起步，已經進行過環狀RNA研究的物種數量還非常有限。因此，對新物種中環狀RNA表達譜進行系統性研究就成為了發表SCI文章的一條捷徑。 云序生物客戶發表的這項成果是全世界首篇對非洲爪蟾環狀RNA進行系統性研究的文章，也為廣大研究人員提供了一個非常好的模板，即：如何通過環狀RNA高通量測序和生物信息學分析，在不進行功能和分子機制研究的情況下，短平快的發表一篇影響因子不錯的文章，非常具有借鑒意義。

參考文獻：

Identification of circular RNAs and their alterations involved in developing male Xenopus laevis chronically exposed to atrazine

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