用戶文章IF=15.1|余健秀團隊再次攜手云序，揭示TBK1介導的AGO2磷酸化促進肺*發生

肺*，尤其是非小細胞肺*(NSCLC)，仍然是世界范圍內死亡的主要原因。雖然先進的**方法已經應用于肺*的**，但對于一些非小細胞肺*患者仍然沒有有效的**策略?；赗NA的**是一個很有前途的領域，近年來引起了人們的**關注。例如，miRNA可通過降解靶向mRNA或抑制翻譯參與轉錄后水平的基因表達調控，其中一些致*miRNA在非小細胞肺*中高表達，參與**的發生、發展和轉移。在人體內，原代miRNA首先被加工成前體miRNA，進一步被加工成miRNA雙鏈,雙鏈被募集到AGO2上并解鏈，從而開始形成成熟的miRNA誘導的沉默復合體(miRISC)。然而，成熟miRNA如何裝載到AGO2中的詳細機制，以及未知的AGO2關鍵修飾是否參與miRISC的形成和miRNA活性尚不清楚。另外，TBK1（Tank-binding kinase 1）也參與*癥進展，能夠通過磷酸化IRF3和IRF7來**I型IFN和抗病毒免疫，干擾素基因刺激因子(STING)與TBK1結合，該位點位于TBK1的經典激酶**環內。

因此，抗致*miRNA**是一種有潛力且有效的**方法，基于miRNA的聯合**策略有望改善**反應，而關鍵的挑戰是探索有效的靶miRNA和組合方法!

2024年2月13日，云序客戶上海交通大學基礎醫學院余健秀教授團隊在Advanced Science（IF=15.1）上發表了題為“Phosphorylation of AGO2 by TBK1 Promotes the Formation of Oncogenic miRISC in NSCLC”的研究性論文。在此項工作中，作者揭示了由TBK1介導的AGO2磷酸化修飾，通過調節**細胞中高豐度且具有促*功能的miRNAs裝載形成miRISC復合物，進而影響**細胞基因表達模式，調控非小細胞肺*（NSCLC）發**展的新分子機制。因此，靶向AGO2磷酸化可能為非小細胞肺*的**提供一種潛在的新策略。

云序生物已與該課題組多次進行合作，并攜手發表多篇高分文章！

本文是云序生物與該課題組合作的“第四篇”高分文章!該研究中的miRNA-Seq、mRNA-Seq、 RIP-Seq等高通量測序技術均由上海云序生物公司提供。

下面我們就一起來看看這篇文章的研究思路和成果吧~~

標題：Phosphorylation of AGO2 by TBK1 Promotes the Formation of Oncogenic miRISC in NSCLC

發表時間：2024年2月13日

發表期刊：Advanced Science

影響因子：IF=15.1/Q1

研究方法： miRNA-Seq、mRNA-Seq、 RIP-Seq、RIP-qPCR

研究摘要

非小細胞肺*(NSCLC)是一種高致死性**，經常對靶向**產生耐藥性。研究表明，TBK1磷酸化AGO2的S417位點(pS417-AGO2)，通過增加microRNA誘導的沉默復合體(miRISC)的形成促進NSCLC的進展。臨床NSCLC標本中高水平的pS417-AGO2與不良預后呈正相關。有趣的是，使用表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑吉非替尼(Gefitinib)**可以**誘導pS417-AGO2，從而增加致*miRISC的形成和活性，這可能有助于NSCLC對吉非替尼的耐藥。在此基礎上，提出了兩種**策略。一種是聯合拮抗NSCLC中高表達的多種致*miRNAs，并使用TBK1抑制劑氨來呫諾(Amlexanox)減少致*miRISC的形成。另一種方法是吉非替尼聯合氨來呫諾抑制吉非替尼耐藥NSCLC的進展。這一發現揭示了TBK1介導的pS417-AGO2調控致*miRISC的新機制，并為非小細胞肺*的**提供了潛在的方法。

圖文摘要

技術路線

*紅色部分技術服務云序均可提供

研究結果

1、TBK1通過與AGO2直接相互作用，促進miRNA引導的基因沉默

為了研究TBK1是否參與miRNA活性的調節，作者將轉染GFP-4×miR21-BS質粒的H1299和A549細胞用IL-1β處理指定時間，然后收集細胞進行Western blotting (WB)分析GFP蛋白和pS172TBK1的水平。作者發現pS172-TBK1和miR-21的活性隨著時間的推移而平行增加，以響應IL-1β的刺激(圖1A,B)，表明TBK1可能參與miRNA活性的調節。

因此，作者想知道AGO2是否與TBK1有物理相互作用。HeLa細胞的裂解物與抗TBK1(圖1C)或抗AGO2抗體(圖1D)進行相互免疫共沉淀實驗(Co-IP)，然后進行WB分析，顯示內源性AGO2確實與TBK1相互作用。為了進一步證實AGO2與TBK1之間的直接相互作用，作者進行GST下拉實驗，結果表明TBK1直接與AGO2結合(圖1E)?？紤]到AGO2是一種RNA結合蛋白，作者進一步證實了這種相互作用是**于RNA的(圖1F)。TBK1與pS172-TBK1一起被脂多糖(LPS)和病原體核酸**，觸發TLR3/4和cGAS-STING信號軸的**。有趣的是，LPS處理后，HeLa細胞中AGO2與活性形式pS172TBK1的相互作用**增強(圖1G)。

接下來，作者試圖探索TBK1是否影響AGO2介導miRNA引導的基因沉默的功能。作者構建了一個失活的TBK1突變體，在172位(S172A)用丙氨酸取代了絲氨酸，這取消了它的自磷酸化和**。然后作者將miR-21或let-7a模擬物、Myc-AGO2、Flag-TBK1WT或FlagTBK1S172A共轉染到HeLa細胞中，然后通過WB分析確定PTEN或HMGA2的表達水平，因為PTEN和HMGA2分別是miR-21和let-7的直接靶點。結果顯示，AGO2分別增強了miR-21或let-7a對PTEN或HMGA2表達的抑制作用，TBK1 -WT**增強了這種抑制作用，TBK1-S172A則沒有(圖1H)。

此外，作者采用了miR-21或let-7 miRISC熒光素酶報告基因實驗，發現AGO2**增強了對熒光素酶報告基因活性的抑制作用，TBK1-WT能**增強這種抑制作用，TBK1-S172A則不能(圖1I)，并進一步證實這一點，得到了類似的結果，GFP表達水平受到AGO2的抑制，TBK1-WT的作用更為明顯，TBK1-S172A的作用則不明顯(圖1J).

為了研究TBK1是否在AGO2介導的基因切片中發揮作用，作者設計了一個含有天然mir -21靶向序列的5 ' -生物素- mir -21靶RNA。將Flag-AGO2與TBK1-WT或TBK1-S172A共轉染的293T細胞裂解液與抗flag抗體共轉染，然后用3xFlag肽純化AGO2復合物。生物素-miR-21靶RNA、miR-21雙工(圖1K)或pre-miR-21(圖1L)與/不含AGO2復合物孵育，進行體外靶RNA切片實驗。結果表明，在沒有AGO2配合物的反應中，沒有觀察到裂解產物。

綜上所述，上述結果表明TBK1直接與AGO2相互作用，并依賴于其激酶活性促進miRNA引導的基因沉默。

圖1：TBK1直接與AGO2相互作用，促進miRNA引導的基因沉默

2、TBK1促進miRNA裝載到AGO2上，形成有效的miRISC

接下來，作者研究了TBK1通過miRISC調節miRNA介導的基因沉默效率的機制。

成熟miRISC的形成至少涉及兩個步驟:將miRNA雙鏈(miRNA/miRNA*)加載到AGO2上，然后解開miRNA雙鏈，AGO2選擇miRISC內的引導鏈。因此，作者首先進行了體外miRNA加載實驗，以確定TBK1是否參與了miRNA加載到AGO2上的過程。

TBK1敲除(通過CRISPR-Cas9系統)HeLa細胞的裂解物通過抗AGO2抗體免疫沉淀(IP-ed)，然后將蛋白A/G珠與純化的生物素- mir -21雙工共孵育。通過Northern blotting (NB)檢測，加載到AGO2上的引導鏈在TBK1缺乏時**減少(圖2A)。同樣，通過使用生物素標記的pre-let-7a-3，成熟的let-7a與AGO2的結合通過TBK1的敲低(與shRNA一起)而**降低，而通過miRNA的過表達而**增強。這些結果表明TBK1可以促進miRNA裝載到AGO2。

為了進一步研究TBK1的這種作用是否依賴于它的激酶活性，作者使用共轉染TBK1-WT或失活突變體TBK1-S172A和Flag-AGO2的293T細胞的裂解物進行了類似的體外miRNA加載實驗。在IP中分別添加純化的生物素- mir -21雙工(圖2B)和生物素標記的premiR-21(圖2C)。通過NB檢測裝載到AGO2上的引導鏈/成熟的miR-21，表明TBK1-WT**增加了成熟的miR-21與AGO2的結合，而TBK1-S172A在體外沒有增加(圖2B,C)。此外，作者還進行了體內RIP-NB實驗，得到了相同的結果，即TBK1缺乏減少(圖2D)，而TBK1過表達增加了內源性miR-21(圖2E)或miR-let-7a加載到miRISC的AGO2中，這需要其激酶活性(圖2E)。

為了驗證TBK1促進miRISC的形成，將短暫表達Flag-AGO2和TBK1-WT或TBK1-S172A的293T細胞裂解物與鏈親和素- dynabeads耦合的生物素化的miR-21雙工模擬物一起孵育進行下拉實驗，結果顯示TBK1-WT**增加了招募到miR-21模擬物的AGO2(微粒)，而TBK1-S172A則沒有(圖2F)。作者還在體外對miR-21雙鏈模擬物進行了展開實驗，結果顯示TBK1-WT**增加了miR-21雙鏈模擬物雙鏈RNA (dsRNA)展開的單鏈RNA (ssRNA)分子，而TBK1-S172A則沒有(圖2G)，表明TBK1促進了AGO2介導的miRNA雙鏈展開。此外，作者進行了risc捕獲試驗，其中生物素標記的miR-21靶RNA與293T細胞的細胞裂解液一起孵育，共轉染了指定的質粒和miR-21雙工模擬物，以拉下活化的成熟miRISC。結果顯示，生物素標記的miR-21靶向RNA捕獲的AGO2:miRNA復合物被TBK1-WT強烈增強，而TBK1-S172A則沒有，這表明TBK1促進了miRISC的形成(圖2H)。為了進一步證實TBK1的激酶活性對于miRNA裝載和miRISC的形成是特別需要的，作者在實驗中引入了具有n端附著肉豆蔻?；盘柕膍yr-AKT1的組成活性形式。Flag-AGO2與TBK1-WT、TBK1-S172A或TBK1S172A/myr-AKT1共轉染至293T細胞。裂解物用于體外miRNA裝載實驗和生物素化miRNA-鏈親和素拉下實驗。結果顯示，TBK1-WT**增加了成熟miR21對AGO2的裝載，而TBK1S172A、TBK1S172A和myr-AKT均未增加成熟miR21對AGO2的裝載。

綜上所述，上述結果表明TBK1以激酶依賴的方式促進miRNA加載到AGO2和miRISC的形成。

圖2：TBK1促進miRNA的裝載和miRISC的形成

3、TBK1磷酸化AGO2的S417位點，增強miRISC的形成和活性

由于TBK1直接與AGO2相互作用，作者推測AGO2是TBK1的底物。為了證實這一點，進行了幾次生物化學實驗。轉染或不轉染Flag-TBK1的MycAGO2的293T細胞用抗磷酸化ser /Thr (pS/T)抗體裂解成IP，然后用antiMyc抗體裂解成WB，結果顯示TBK1的過表達比載體提高了AGO2的pS/T水平(圖3A)。相反，TBK1的敲低降低了HeLa細胞中AGO2的pS/T水平(圖3B)。此外，將細菌表達的GST-AGO2蛋白加入到異位表達TBK1的293T細胞或載體的裂解物中孵育過夜，隨后用GST珠拉下，用抗ps /T抗體進行免疫印跡，結果表明，與過表達TBK1的293T細胞的裂解物孵育的GST-AGO2蛋白磷酸化水平遠高于轉染對照載體的細胞(圖3C)。體外激酶實驗也進行了，其中細菌表達的GST- AGO2和純化的Flag-TBK1從293T細胞在激酶緩沖液**孵育反應，隨后GST珠拉下，抗ps /T抗體免疫印跡。結果表明TBK1能夠在體外催化AGO2磷酸化(圖3D)。以上結果表明TBK1是AGO2的新激酶。

為了鑒定TBK1依賴性AGO2磷酸化位點，作者首先使用PhosphoSitePlus程序預測AGO2蛋白的序列QPPS417*ILY是TBK1的高度保守基序。作者已經通過質譜分析證實S417確實被磷酸化。轉染了Myc-AGO2WT或點突變體Myc-AGO2S417A的293T細胞用抗pS/T抗體裂解IP，隨后用抗myc抗體進行免疫印跡分析，結果顯示與AGO2WT相比，AGO2S417A的pS/T水平**降低(圖3E)，提示S417是AGO2的磷酸化位點。Phostag SDS-PAGE分析進一步證實了S417是AGO2的一個主要磷酸化位點(圖3F)。

為了進一步證實AGO2的pS417在體內確實存在，作者自制了一種針對pS417的抗體(antipS417)。為了表征抗體的特異性，作者進行了點印跡實驗，發現抗ps417抗體優先檢測磷酸化肽而不是未修飾的肽。

與圖3D相同的體外激酶實驗顯示TBK1催化pS417-AGO2(圖3G)。使用自制的AGO2特異性抗ps417抗體，將H358細胞裂解物與抗AGO2抗體進行免疫印跡，再用抗ps417抗體進行免疫印跡，發現可以檢測到內源性的pS417-AGO2(圖3H)。作者還證實，通過穩定敲低H1299 (H1299- shTBK1)細胞中的TBK1, pS417-AGO2水平**降低(圖3I)，而通過在H1299 (H1299-TBK1)細胞中異位表達TBK1, pS417-AGO2水平升高(圖3J)。此外，作者檢測了不同細胞類型在脂多糖(lipopolaccharides, LPS)作用指定時間后的pS417-AGO2水平，發現LPS刺激后，不同細胞類型的pS417-AGO2水平均被誘導(圖3K)。相反，Amlexanox可降低A549(圖3L)、H1975和H1299細胞中pS417-AGO2的水平，Amlexanox是TBK1的特異性抑制劑，用于**復發性阿弗頓潰瘍。綜上所述，作者證明了TBK1在體外和體內特異性磷酸化了S417位點的AGO2。

為了確定pS417-AGO2是否參與miRISC的形成和活性，作者進行了4個類似的實驗，如圖2所示。體外miRNA加載實驗顯示，與AGO2WT相比，miR-21加載到AGO2S417A的引導鏈減弱(圖3M)。dsRNA展開實驗顯示，與AGO2WT相比，AGO2S417A減少了miR-21-duplex (dsRNA)形成的miR21-guide (ssRNA)分子(圖3N)。生物素化的miRNA-Streptavidin下拉實驗顯示，與AGO2WT相比，招募到miR-21模擬物的AGO2S417A(微珠中)明顯減少(圖30)。**，體外靶RNA切片證明AGO2WT組比AGO2s417aggroup組有更多的裂解產物(圖3P)。綜上所述，TB磷酸化AGO2的S417位點，增強miRISC的形成和活性。

圖3：TBK1磷酸化AGO2位點以增強miRISC的形成和活性

4、pS417-AGO2促進NSCLC進展

為了探究pS417-AGO2的生物學功能，作者首先用特異性抗ps417抗體檢測了不同肺*細胞系中pS417-AGO2的水平。其中WI38/VA13為正常人肺成纖維細胞系，16HBE為正常人支氣管上皮細胞系，其余為NSCLC細胞系。結果顯示，NSCLC細胞系中pS417-AGO2的表達水平遠高于正常細胞系(圖4A)。作者在H358-shAGO2和H1299-shAGO2中產生了穩定的再表達AGO2WT或AGO2S417A，其中內源性AGO2通過慢病毒shRNA系統被沉默。為了探討pS417-AGO2是否影響細胞轉化潛能，作者對穩定的H358細胞系進行了軟瓊脂集落形成實驗。結果表明，內源性AGO2在H358細胞中沉默減少不依賴錨地的菌落形成和生長;通過重新表達AGO2WT而不是突變體AGO2S417A來挽救(圖4B)。三維培養實驗表明，敲低AGO2可使H1299細胞不再滲透到基質中，而是生長成緊密的菌落。重新表達的AGO2WT細胞彌漫性增殖，形態分散，具有很強的侵襲細胞外基質的能力。相比之下，AGO2S417A細胞生長成致密的圓形集落(圖4C)。與這些結果一致的是，異位表達AGO2WT而非AGO2S417A促進了血管源性模仿(VM)的形成(圖4D)。為了進一步研究pS417-AGO2是否也在體內影響**生長，作者將上述穩定的H1299細胞系皮下接種到裸鼠背部進行異種移植**生長實驗。作者拍攝了照片(圖4E)，并測量了**的重量(圖4F)，結果顯示，與AGO2WT相比，AGO2S417A組**的大小和平均重量都減小了。作者已經證實，在AGO2WT異種移植**中，pS417-AGO2的水平遠高于AGO2S417A異種移植**。

接下來，作者通過WB檢測NSCLC標本及其配對的鄰近正常組織中pS417-AGO2的水平，發現**中pS417-AGO2的水平明顯高于鄰近正常組織。為了進一步支持這一點，作者使用pS417AGO2抗體進行免疫組化染色(IHC)，檢測非小細胞肺*組織陣列和肺*組織陣列中pS417-AGO2的水平，結果顯示，**組織中pS417-AGO2的水平明顯高于正常組織(圖4H-J)。作者還發現病理亞分期組中pS417-AGO2水平不同。重要的是，pS417-AGO2/AGO2比值在NSCLC樣本中**升高(圖4K)，且與**分級呈正相關(圖4L)。與觀察到的pS417AGO2水平變化相反，AGO2蛋白總體水平保持相對穩定，表明NSCLC與正常組織之間無明顯變化。在分析的樣本中，83.33%的NSCLC樣本顯示pS417-AGO2水平升高，5%的病例觀察到pS417-AGO2水平下降。相反，在AGO2蛋白水平上，33.33%的NSCLC樣本呈上升趨勢，53.33%的NSCLC樣本呈下降趨勢。

綜上所述，上述研究結果表明pS417-AGO2促進NSCLC的發展，pS417-AGO2高水平與NSCLC的進展呈正相關，提示pS417-AGO2高水平是NSCLC的危險因素，可能是潛在的**靶點。

圖4：AGO2在S417位點的磷酸化促進了NSCLC的進展

5、在NSCLC中，pS417-AGO2促進高豐度致*miRNAs進入AGO2

為了探究pS417-AGO2對miRNA通路的全局影響，作者對上述穩定細胞H1299-shAGO2-Flag-AGO2WT和H1299-shAGO2Flag-AGO2S417A進行了miRNA-Seq、AGO2 - RIP-Seq和mRNA-Seq三個高通量測序?；?/span>miRNA-Seq，對miRNA譜進行分析，發現AGO2WT和AGO2S417A之間有少量miRNA發生了變化。AGO2 - RIP-Seq結果顯示，通過累積分布曲線(圖5A)和密度分布圖(圖5B)分析，與AGO2S417A相關的miRNA較與AGO2WT相關的miRNA明顯減少。

根據與AGO2S417A和AGO2WT的結合能力，作者將miRNA分為低親和組(RIP下調富集，log2 [fold change] < 0.5, RIP/input≥1)和高親和組(RIP上調，log2 [fold change]≥0.5,RIP/input≥1)。分布圖分析顯示，低親和組的miRNA多于高親和組(圖5C)?？赡苄枰猵S417-AGO2來裝載參與細胞增殖、耐藥、免疫反應和自噬調控的關鍵miRNA，如miRNA-21、miR-155、miR-17和miR-221(圖5C)。綜合分析上述AGO2 - RIP-Seq和miRNA-Seq數據，作者發現H1299細胞中豐度排名***位的miRNA所占比例約為92%。*豐富的五個miRNA，包括miR-100-5p、miR-148-3p、miR-10a-5p、miR-24-3p和miR21-5p，屬于低親和力組(圖5D)，*重要的是，它們是致*miRNA。與AGO2WT相比，*豐富的miRNA對AGO2S417A的親和力**降低（圖5E）。為了進一步證實這一點，作者通過RIP-qRT-PCR顯示，*豐富的內源性miRNA，包括miR100-5p、miR-148-3p、miR-10a-5p、miR-24-3p、miR-21-5p和miR-9-5p，與AGO2S417A的結合水平明顯低于與AGO2WT的結合水平(圖5F)。

為了確定pS417-AGO2轉錄后調控的基因表達，根據log2 [fold change]≥0.5(上調)或log2 [fold change] < 0.5(下調)的標準篩選mRNA-Seq的差異表達基因(DEGs)。與AGO2WT組相比，作者在AGO2S417A組中發現了2210個上調轉錄本和1743個下調轉錄本。作者進一步探討了pS417-AGO2對靶mRNA水平的影響。選擇TargetScan、miRTarBase和miRDB三種生物信息學工具同時預測的miRNA靶標進行累積分數分析，結果顯示AGO2S417A組中低富集miRNA靶標比AGO2WT組中更豐富(圖5H)。同樣，AGO2S417A組***個富集miRNA的靶mRNA水平也遠高于AGO2WT組(圖5I)。上述結果表明，pS417-AGO2促進了高豐度的致*miRNA加載到AGO2中，促進了NSCLC細胞中靶mRNA的降解和翻譯抑制。

為了進一步揭示miRNA靶點的生物學作用，作者對KEGG/Canonical Pathways和Hallmark/Reactome Gene Sets進行了功能富集分析，發現***個miRNA靶點富集于*癥相關通路，如*癥、細胞周期、細胞凋亡等通路(圖5J,K)。綜合富集分析發現，***位miRNA的靶點主要參與**發**展的調控(圖5L)。此外，作者還對AGO2S417A和AGO2WT組之間的DEGs進行了KEGG/Canonical Pathways和Hallmark/Reactome Gene Sets的功能富集分析，結果顯示，DEGs也富集于*癥相關通路，如*癥通路、細胞-細胞外基質(ECM)相互作用、細胞周期。此外，基因本體(Gene Ontology, GO)分析顯示，在細胞外基質結合、細胞粘附調控等不同的基因簇中富集了DEGs。綜合富集分析顯示，pS417-AGO2調控的DEGs也參與了*癥通路，這與***名miRNA靶點的功能特性高度一致(圖5L)。

為了評估***個miRNA靶點與pS417-AGO2調控的deg之間的交叉，作者對miRNA靶點和DEG進行了綜合分析。Circos圖顯示了***個miRNA靶點和DEG之間的部分重疊，表明兩個數據集中的通路趨同。為了**比較重要的途徑，作者使用Metascape對miRNA靶點和DEGs進行了途徑富集分析，以進行Meta分析。結果表明，miRNA靶點和DEGs之間的富集通路存在大量重疊(圖5M)。

綜上所述，這些結果表明p417-AGO2主要通過增加miRISC的形成來調節基因表達譜。

圖5：AGO2在S417位點的磷酸化促進了NSCLC的進展

6、聯合拮抗致*miRNAs和減少致*miRISC的形成來**NSCLC

作者發現，在非小細胞肺*中，將高度豐富的致*miRNA裝載到AGO2中形成miRISC的數量增加，這表明干預或減少這些致*miRISC的形成可能是一種很有希望的抗****策略。確定每種疾病類型的**miRNA候選物或靶點仍然是開發基于miRNA的**方法的重大挑戰。結合作者的RIP-Seq數據，作者進一步分析了TCGA (the Cancer Genome Atlas)數據庫中30種**類型的miRNA-Seq數據，以找到高豐度的miRNA。為了開發一種新的基于miRNA的非小細胞肺***策略，作者通過單變量cox分析篩選了**的miRNA組合。作者使用一組以miR-21為中心的高豐度miRNA進行了多靶點組合分析。單因素cox分析顯示，miR-21、miR-9和miR-10b聯合**是***的**策略(圖6A)。通過分析公開的臨床數據，作者發現在臨床大樣本NSCLC病例中miR-21、miR-9和miR-10b的表達水平**升高與配對正常組織相比(GEO數據庫GSE137140)，Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-21、miR-9或miR-10b高水平的患者在多種**中的生存率較低(圖6B)。作者還通過IP - NB檢測了miR-21、miR-9和miR-10b在異種移植**中的裝載(圖4E)，結果表明，這三種miRNA在AGO2WT組的異種移植**中的裝載均高于AGO2S417A組(圖6C)，表明它們的功能受到pS417-AGO2的調控。

為了探索選定的miRNA在NSCLC中的作用，使用合成miRNA拮抗劑的拮抗劑進行集落形成試驗。通過使用三種類型的拮抗劑分別抑制miR-21、miR-9和miR-10b，菌落數量明顯減少，而加入TBK1抑制劑Amlexanox進一步增強了對H1299和A549細胞的抑制作用(圖6D,E)。這一結果表明，除了這三種抗他高藥物外，Amlexanox還通過抑制pS417-AGO2水平干擾致*miRISC的形成，從而發揮增強的協同抑制作用。

為了進一步了解上述策略的體內**效果，作者將H1299細胞皮下注射到裸鼠體內。發現與antagomiR(NC)相比，antagomiR(21)**可**減小**大小(圖6F、G)和重量(圖6H)。更重要的是，antagomiRs(21+9+10b)對**生長的抑制作用比antagomiR(21)更明顯，表明多靶點策略對致*miRNAs的抑制作用優于單靶點策略。

此外，為了研究antagomiRs和Amlexanox在體內的聯合**效果，小鼠腹腔注射Amlexanox(25 mg k?1 g)，每周2次。與單用Amlexanox相比，Amlexanox與Amlexanox聯合**(21+9+10b)對**生長的抑制作用**(圖6F-H)。這些結果表明，聯合拮抗致*性miRNA和Amlexanox降低致*性miRISC形成的**策略為發展基于miRNA的非小細胞肺***提供了有效途徑。

圖6：聯合拮抗致*miRNAs和減少致*miRISC的形成來**NSCLC

7、吉非替尼聯合氨來呫諾**耐藥NSCLC

盡管EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)為晚期NSCLC患者提供了一種有效的**方法，但克服NSCLC患者對EGFR-TKIs獲得性耐藥的**策略仍有待確定。

有趣的是，作者發現EGFR的**選擇性TKI吉非替尼在H1299-shAGO2-AGO2WT中**增加(圖7A)， miR-21和miR-10b(圖7B)在AGO2上的裝載，而在H1299-shAGO2-AGO2S417A細胞中沒有。更重要的是，在H1299-Flag-AGO2細胞中，添加氨來呫諾可以抑制吉非替尼誘導的pS417-AGO2(圖7C)。因此，吉非替尼**增加了三種致*miRNA miR-21、miR-10b和miR-9在AGO2中的負荷，而與氨來呫諾共****降低了這一載量(圖7D)。不同NSCLC細胞中pS417-AGO2水平差異**。值得注意的是，結果顯示PC9和HCC827中的pS417AGO2水平明顯低于PC9/GR(吉非替尼獲得性耐藥)、HCC827/GR(吉非替尼獲得性耐藥)和其他細胞。PC9和HCC827細胞的區別在于EGFR外顯子19缺失突變的存在，這使得它們對EGFR- tkis有明顯的反應。長時間暴露于吉非替尼后，從其親本敏感細胞株PC9和HCC827中建立PC9/GR和HCC827/GR細胞。H1299和H1975細胞對吉非替尼也相對不敏感。氨來呫諾**降低了PC9/GR細胞和HCC827/GR細胞中的pS417-AGO2水平。與親代PC9和HCC827細胞相比，PC9/GR和HCC827/GR細胞對吉非替尼的耐藥性明顯增強。由于吉非替尼通過TBK1介導的pS417-AGO2增強了致*miRISCs的形成和活性，這可能有助于吉非替尼獲得性耐藥，作者推測與氨lexanox聯合**可能克服吉非替尼耐藥。因此，作者比較了單藥氨來呫諾或吉非替尼與雙藥聯合對PC9/GR、HCC827/GR、H1299和H1975細胞生長的抑制作用。氨來呫諾與吉非替尼聯用**增強了對PC9/GR(圖7E)、H1975(圖7F)、HCC827/GR、H1299細胞生長的抑制作用。

接下來，作者探討了吉非替尼和氨來呫諾聯合**耐藥NSCLC的體內**策略。作者使用PC9/GR細胞進行體內實驗。作者比較了使用較低劑量的吉非替尼(20mg k?1g)和氨來呫諾(20mg k?1g)在PC9/GR細胞中建立的**中的**效果。裸鼠皮下注射PC9/GR細胞。兩周后，小鼠灌胃吉非替尼，腹腔注射/不注射氨來呫諾。結果顯示，與吉非替尼或氨來呫諾單藥**相比，雙藥聯合****消退明顯(圖7G-K)。與載藥組和單藥組相比，聯合**組**的平均大小(圖7I,J)和重量(圖7K)均有**降低。

吉非替尼和氨lexanox聯合**可**抑制**生長，且體重沒有明顯下降(圖7L)。與體內PC9/GR細胞的實驗結果一致，雙藥聯合**比吉非替尼**更有效地抑制**生長，且體重沒有明顯下降。

綜上所述，這些結果表明，致*miRNA裝載部分促成了EGFR-TKI耐藥，與氨來呫諾聯合**是克服NSCLC EGFR-TKI耐藥的一種特別有效的方法。

圖7:吉非替尼聯合氨來呫諾**耐藥NSCLC

全文小結

• 本研究中發現TBK1是一種新的激酶，可以磷酸化AGO2的S417位點，并且可以被EGFR-TKI吉非替尼藥物誘導。

• 高水平的pS417-AGO2通過增加致*miRISCs的形成和活性，促進非小細胞肺*的進展和對吉非替尼的耐藥。

• 臨床標本中高水平的pS417-AGO2與肺*患者預后不良呈正相關，是非小細胞肺*的高危因素之一，提示pS417-AGO2水平的測定可能成為臨床新的診斷指標。

• 揭示了使用TBK1抑制劑氨來呫諾降低pS417-AGO2是**非小細胞肺*的一個好策略，為非小細胞肺*的**提供了潛在的方法。

云序生物“分子互作組研究”

云序生物聚焦于科研前沿領域，除RNA修飾、轉錄組及eccDNA研究等特色服務外，還提供“各類分子互作組研究”服務，包括DNA-蛋白互作、RNA-蛋白互作、DNA-RNA互作等各項檢測技術和系統性解決方案，助力探究深層分子作用機制！

云序多組學方案

云序相關產品

1. RIP-seq/qPCR/GenSeq? RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

3 ChIP-Seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

4. Ribo-Seq

篩選翻譯水平發生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

5.SLAM-Seq

篩選穩定性發生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

6.CHIRP-Seq

篩選或驗證目標RNA與DNA互作，研究相應的分子機制。

7. ssDRIP-Seq

R-loop結構的DNA檢測，研究相應的分子機制。

8. DRIPc-Seq

R-loop結構的RNA檢測，研究相應的分子機制。

云序客戶分子互作高分文章

往期回顧

1. 云序客戶余健秀課題組m6A方向再次取得重大發現——SUMO化促進YTHDF2結合m6A修飾的mRNA影響*癥進展

2. 1區 IF: 21|云序MeRIP-Seq & RIP-Seq助力肺動脈高壓中m6A閱讀蛋白YTHDF1機制研究

3. RIP-seq項目文章|nature子刊揭示低氧誘導AGO2線性泛素化調控**發**展機制

4. 云序客戶m6A高分文章|揭示組蛋白乙?；cm6A修飾在眼部黑色素瘤發生中的共同作用機制

5. 用戶文章 IF=19.2|范先群院士團隊利用m1A MeRIP-seq聯合多組學測序揭示眼黑色素瘤調控新機制

6. 云序客戶| m6A MeRIP-seq助力揭示早發糖尿病表觀調控新機制

7. 云序客戶| MeRIP-seq+RIP-seq技術揭示 m6A 甲基化調控BMSCs成骨分化新機制

8. 客戶文章| Nature子刊 揭示了FMR1通過m6A修飾調控早期胚胎發育的分子機制

9. 用戶文章 1區 lncRNA m6A甲基化測序助力人脂肪干細胞成骨分化的調控機制研究

10. 高分論文利器：云序RIP-seq在RNA甲基化，環狀RNA等機制解析中的應用實例

11. 云序用戶文章|IF=19.865，多組學分析助力非酒精性脂肪性肝病發病機制研究

上海云序生物科技有限公司

Shanghai Cloud-seq Biotech Co.，Ltd.

地址：上海市松江區莘磚公路518號24號樓4樓

電話：021-64878766

網址：www.cccppp1.com