用戶文章 IF=13.6|AHR介導的 m6A RNA甲基化是 PM2.5 誘導斑馬魚幼體心臟畸形的原因之一

越來越多的證據表明，暴露于環境中的細顆粒物（PM2.5）會抑制心臟發育，但其潛在機制仍然難以捉摸。2023年9月，云序客戶蘇州大學陳濤團隊在Journal of Hazardous Materials（IF=13.6）上發表題為“AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae”的研究性論文。在這項研究中，通過m6A Merip-seq、 RNA-seq 等實驗證明了 PM2.5 中的可萃取有機物（EOM）會**降低斑馬魚幼體心臟中全局 m6A RNA 甲基化水平，而甲基供體甜菜堿則可恢復這一水平。甜菜堿還能減輕 EOM 誘導的 ROS 過度生成、線粒體損傷、細胞凋亡和心臟缺陷。此外，作者發現 EOM **的芳基碳氫化合物受體（AHR）直接抑制了甲基轉移酶 mettl14 和 mettl3 的轉錄。EOM 還誘導了全基因組 m6A RNA 甲基化變化，還發現，EOM上調了traf4a和bbc3這兩個凋亡相關基因的表達水平，但通過強制表達mettl14，它們的表達水平又恢復到了控制水平。

該研究中的m6A MeRIP-seq 、RNA-seq 高通量測序均由上海云序生物公司提供。

研究背景

環境細顆粒物（PM2.5）是影響全球健康的一個主要風險因素，很容易進入循環系統并穿過胎盤屏障，對胎兒發育造成不利影響。先天性心臟?。–HD）是人類*常見的先天性缺陷，約占所有活產嬰兒的 1%。先天性心臟病的病因尚不清楚，但目前認為是由遺傳和環境因素共同作用造成的。多項流行病學研究表明，孕期暴露于 PM2.5 與后代的先天性心臟病密切相關。動物研究也表明，暴露于 PM2.5 會**增加小鼠、雞和斑馬魚的心臟畸形率。然而，PM2.5 的心臟發育毒性的內在機制仍有待闡明。

研究結果

（1）甲基供體甜菜堿減輕了EOM誘發的心臟缺陷并減少了m6A甲基化

我們首先檢測了EOM中16種EPA優先考慮的多環芳烴的濃度，并確定了其中9種的存在。BaP當量為25.9納克/立方米。由于采樣期間 PM2.5 的平均水平為 66.5 微克/立方米，因此本研究中 EOM 的暴露濃度（5 毫克/升）大致相當于 1.95 微克/升 BaP，這是一個與環境相關的濃度水平。然后，我們研究了甲基供體甜菜堿對 EOM 的心臟發育毒性的影響。如圖 1A 和 B 所示，補充甜菜堿可**減輕 EOM 引起的心臟畸形（即心包水腫、心臟變長）和心功能障礙（表現為心跳率下降和 QT/RR 間期延長）。此外，EOM還明顯降低了斑馬魚幼體心臟中m6A RNA的全局甲基化水平，而加入甜菜堿后，這一水平又恢復到了控制水平（圖1C）。

圖 1. 72 hpf 時斑馬魚幼體的心臟缺陷和總體 m6A 水平（n ≥ 5）

（A）72 hpf 時斑馬魚幼體的代表性圖像，以及胚胎存活率、心臟畸形率和心包面積的量化結果。虛線環繞心房（藍色）或心室（紅色）

（B）心跳強度和量化結果。bpm：每分鐘心跳次數；QT：Q 波和 T 波之間的間隔；RR：R 波之間的間隔。

（C）m6A 甲基化水平的代表性圖像和量化結果。EOM：濃度為 5 mg/L 的 EOM；BT：濃度為 5 μM 的甜菜堿。不同字母表示差異**。

（2）甜菜堿可減少 EOM 誘導的 ROS 生成、MMP 崩潰和細胞凋亡

如圖2A和圖B所示，EOM**增強了斑馬魚幼體心臟細胞內ROS和mtROS的產生，而添加甜菜堿則可抵消這種作用。甜菜堿還減輕了EOM誘導的氧化應激相關基因（包括nrf2a、sod2、cat、gstp1和gstp2）的過表達。此外，EOM降低了斑馬魚胚胎心臟中MMP的水平并增強了細胞凋亡，而補充甜菜堿后這兩種情況都得到了恢復（圖2 C和D）。

圖2. 72 hpf 時斑馬魚幼體的氧化應激和細胞凋亡水平（n ≥ 3）。

（A）ROS 信號及量化結果。

（B）MitoSOX 信號及量化結果。

（C）MitoTracker 信號及量化結果。

（D）AO 染色的代表性圖像和量化結果。EOM：濃度為 5 mg/L 的 EOM；BT：濃度為 5 μM 的甜菜堿。不同字母表示差異**。

（3）EOM 通過 AHR 介導的 mettl14/ mettl3 下調抑制 m6A RNA 甲基化

如圖 3A 所示，通過藥物抑制劑 CH 或基因敲除抑制 AHR 的活性，可以抵消 EOM 降低的全局 m6A RNA 甲基化水平，這表明 AHR 介導了 EOM 誘導的 m6A RNA 甲基化變化。CH 已被用作斑馬魚胚胎和人類上皮細胞中的 AHR 拮抗劑。我們進一步檢測了 m6A 調控因子（包括 METTL14、KIAA1429和 FTO）的 mRNA 表達水平。圖 3B 顯示，EOM 明顯降低了 mettl14 和 Mettl3 的 mRNA 表達水平，補充 CH 后這些變化得以恢復。免疫熒光染色顯示，CH或AHR敲除可拮抗EOM下調的Mettl14蛋白表達（圖3C）。AHR 的敲除效率見。我們還發現，陰性對照 MO 對上述結果沒有檢測到影響。為了研究 AHR 是否直接抑制 mettl3 和 mettl14 的轉錄，我們檢測了 mettl3 和 mettl14 的啟動子序列。如圖 3D所示，在這兩個基因的啟動子區域發現了多個可預測的 XRE 位點。此外，體內雙熒光素酶報告實驗表明，EOM能**提高mettl3和mettl14野生型啟動子的熒光素酶活性，而突變體樣本的熒光素酶活性則沒有提高（圖3E）。

圖 3. 72 hpf 時斑馬魚幼體 mRNA 和蛋白表達水平（n ≥ 3）

(A)m6A 抗體染色的代表性圖像及量化結果。

(B)mRNA 表達水平。

(C)Mettl14 抗體染色的代表性圖像及定量結果。

(D)mettl14 / mettl3 啟動子區域的 XRE 位點和體內雙熒光素酶報告結果。* ，突變位點；EOM：濃度為 5 mg/L 的 EOM；CH：濃度為 0.5 μM 的 CH223191；AHRMO：ahr2 嗎啉寡核苷酸。不同字母表示差異具有統計學意義。

(E)雙熒光素酶報告分析

（4）過表達 mettl14 或 mettl3 可減輕 EOM 誘導的 ROS 過度產生和細胞凋亡

如圖 4A 和 B 所示，過表達 mettl14 可**抵消 EOM 誘導的斑馬魚幼體心臟細胞內 ROS 和 mtROS 的產生。AO 染色顯示，過表達 mettl14 可減輕 EOM 誘導的斑馬魚胚胎心臟凋亡（圖 4C）。對裂解的caspase-3的免疫染色進一步證實了過表達mettl14對EOM誘導的心臟凋亡的拮抗作用（圖4D）。同樣，我們發現過表達 mettl3 也能抵消 EOM 誘導的細胞內 ROS/ mtROS 生成和斑馬魚幼體心臟凋亡（圖 4E-G）。

圖 4.過表達 mettl14/3 后 72 hpf 斑馬魚幼體的氧化應激和細胞凋亡水平（n ≥ 3）。

(A,E)ROS 信號及量化結果。

(B,F) MitoSOX 信號及量化結果。

(C,G)斑馬魚心臟 AO 染色的代表性圖像及量化結果。

(D)對裂解的caspase-3的免疫染色

(E）Caspase-3裂解染色的代表性圖像和定量結果。EOM：5 mg/L 的 EOM；Mettl14：mettl14 mRNA；Mettl3：mettl3 mRNA。不同字母表示差異**。

（5) EOM 誘導全基因組 m6A RNA 甲基化變化

MeRIP-seq 結果顯示，m6A 峰主要集中在**編碼區，并**富集在終止密碼子附近（圖 5A）。EOM 在斑馬魚幼體心臟中誘導了**的全基因組 m6A RNA 甲基化變化，6815 個位點上調，918 個位點下調（圖 5B）。富集分析顯示，受影響的基因參與了包括神經嵴細胞遷移和心臟發育在內的重要生物學過程，ECMreceptor interaction、TGF-β、mTOR、Wnt 和 MAPK 信號通路是富集程度**的通路之一（圖 5C）。與*添加EOM組相比，添加CH組進一步誘導了14,608個高甲基化位點和11,455個低甲基化位點（圖6B）。我們重點研究了EOM誘導的m6A RNA甲基化異常變化，CH緩解了這些變化，我們認為這些變化的基因（如圖5D所示，2509個基因位于Q1和Q4）是EOM誘導的心臟缺陷的罪魁禍首。我們注意到，除了 TGF-β 和 MAPK 信號通路外，細胞凋亡也在此時富集（圖 5E，F）。圖 6F 顯示了兩個與細胞凋亡相關的基因 traf4a 和 bbc3 的 m6A RNA 甲基化模式，我們選擇了這兩個基因作進一步研究。

圖 5.暴露于含或不含 CH 的 EOM 的斑馬魚幼體心臟中全基因組 m6A RNA 甲基化變化（n = 3）

(A)減少的 m6A 峰的分布。

(B)火山圖顯示 EOM 與 DMSO 和 EOM_CH 與 EOM 的不同甲基化位點。

(C)EOM 與 DMSO 中不同甲基化位點基因的富集分析。

(D)象限圖反映了 EOM 和 EOM_CH 中差異甲基化基因的分析結果。

(E)Q1 和 Q4 中不同甲基化位點基因的富集分析。

(F)Q2 和 Q4 中存在差異甲基化位點的凋亡相關基因的 Newwork 圖。

(G)重排 m6A RNA 甲基化水平。

（6） mettl14介導了EOM誘導的traf4a和bbc3的過表達

如圖6A所示，EOM樣本中traf4a和bbc3的mRNA表達水平均有所增加，但traf4a的表達量折減相當有限。通過強制表達 mettl14，EOM 上調的這兩個基因的轉錄水平被降至對照水平。無獨有偶，免疫熒光結果也顯示，EOM上調了bbc3的蛋白表達水平，但隨后又被mettl14的過表達所抵消（圖6B）。

圖 6.72 hpf 時斑馬魚幼體的相關基因表達水平（n ≥ 3）。

（A）traf4a 的 mRNA 表達水平。

(B)bbc3染色的代表性圖像及量化結果。EOM：濃度為 5 mg/L 的 EOM。

（7）EOM誘導的氧化應激和細胞凋亡都需要traf4a和bbc3

我們首先發現，敲除traf4a或bbc3都會減輕EOM引起的賁門畸形。如圖 7A 和 B 所示，在斑馬魚胚胎心臟中，敲除 traf4a 或 bbc3 均可終止 EOM 誘導的細胞內 ROS 和 mtROS 過度生成。此外，裂解天冬酶3免疫染色結果表明，敲除traf4a或bbc3可拮抗EOM誘導的斑馬魚胚胎心臟凋亡（圖7C）。

圖 7.traf4a 或 bbc3 基因敲除后 72 hpf 斑馬魚幼體的氧化應激和細胞凋亡水平（n ≥ 3）。

（A）MitoSOX 信號和量化結果。

(B)被裂解的 caspase-3 染色的代表性圖像和量化結果。EOM：5 mg/L的EOM；NC：非特異性對照抗原；不同字母表示差異有統計學意義

全文總結

結果表明，PM2.5的EOM通過AHR介導的mettl14下調誘導了**的m6A RNA甲基化變化，從而增加了traf4a和BBC3的表達水平，導致氧化應激和細胞凋亡，*終導致心臟發育異常(圖8)。由于AHR拮抗劑和甲基供體如黃烷酮、姜黃素和甜菜堿**存在于日常食物中，它們可能是**PM2.5誘導的異常AHR**和m6A RNA甲基化變化的良好候選者。

圖8. 模型顯示AHR介導的m6A RNA甲基化是PM2.5對心臟發育毒性的原因之一。

EOM **的 AHR 通過下調 mettl14 抑制 m6A RNA，進而提高 traf4a 和 bbc3 的表達水平，導致氧化應激和細胞凋亡，*終導致斑馬魚幼體心臟畸形。

參考文獻

Ji C, Tao Y, Li X, Wang J, Chen J, Aniagu S, Jiang Y, Chen T. AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae. J Hazard Mater. 2023 Sep 5;457:131749. doi: 10.1016/j.jhazmat.2023.131749. Epub 2023 Jun

云序生物m6A修飾研究五大模塊

01 m6A RNA修飾測序

m6A RNA修飾測序（m6A-MeRIP-seq）

對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

m6A  mRNA測序

m6A  miRNA測序

02檢測整體m6A修飾水平

比色法檢測整體RNA修飾水平

快速檢測m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選

m6A RNA修飾相關酶PCR芯片

尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗證

MeRIP-qPCR/GenSeq? MeRIP試劑盒

云序提供各類不同修飾的MeRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq? MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

05機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq? RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

5.4 Ribo-seq

篩選翻譯水平發生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

5.5 SLAM-seq

篩選穩定性發生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

5.6 CHIRP-seq

篩選或驗證目標RNA與DNA互作，研究相應的分子機制。

云序生物服務優勢

優勢一：云序累計支持客戶發表100 +篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子1000 +

優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。

優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

優勢四：提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A-MeRIP-seq、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down、Ribo-seq、SLAM-seq、CHIRP-seq、CHIP-seq等。

優勢五：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。

優勢六：國內全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化、假尿嘧啶RNA測序。

云序生物m6A多組學一站式服務

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