云序客戶| m6A MeRIP-seq助力揭示早發糖尿病表觀調控新機制

隨著糖尿病發病率的逐年攀升和發病年齡的年輕化，胰島β細胞發育成熟階段的代謝表觀調控成為胰島領域研究的新熱點，m6A RNA修飾對β細胞功能的重要作用已被證實，但其如何調節胰腺發育和內分泌分化尚不清楚。

2023年11月，云序客戶上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院寧光院士、汪啟迪教授團隊再次在《Diabetes》以“METTL3-mediated m6A Methylation Controls Pancreatic Bipotent Progenitor Fate and Islet Formation.”為題發表論文，通過m6A MeRIP-seq等測序技術揭示了Mettl3介導的m6A甲基化修飾調控胚胎胰腺雙向潛能祖細胞命運和胰島形成新機制，為糖尿病**提供了新的思路。該課題組2020年在《Diabetes》同樣發表過“m(6)A mRNA Methylation Controls Functional Maturation in Neonatal Murine β-Cells”文章，以上兩篇文章的m6A MeRIP-seq等測序技術均由云序生物提供。

標題：METTL3-mediated m6A Methylation Controls Pancreatic Bipotent Progenitor Fate and Islet Formation.（Mettl3介導的m6A甲基化修飾調控胚胎胰腺雙向潛能祖細胞命運和胰島形成）

發表時間：2023年11月14日

發表期刊：Diabetes

影響因子：IF=7.7/Q1

研究方法： m6A MeRIP-seq、scRNA

研究摘要

m6A RNA修飾對β細胞功能的重要作用已被證實，但它如何調控胰腺發育和內分泌分化仍是未知數。在本研究中，作者構建了Pdx1+胰腺祖細胞特異性敲除RNA甲基轉移酶Mettl3的轉基因小鼠，發現該突變小鼠在2周齡時出現***和低胰島素血癥，胰腺萎縮，胰島質量減少，導管形成異常增多。在E15.5，Mettl3缺失導致Ngn3+內分泌祖細的**減少，同時伴隨著Sox9 +導管前體細胞的增加。作者發現組蛋白去乙?；? ( Hdac1 )是雙能祖細胞中關鍵的m6A直接靶點，其變性導致Wnt / Notch信號通路異常**，內分泌分化受阻。這種轉化可以在體外胚胎胰腺培養中通過調控Mettl3-Hdac1-Wnt/Notch信號軸來實現。研究表明，Mettl3通過調節雙能祖細胞轉換過程中的Hdac1活性來決定內分泌譜系，這可能有助于開發用于糖尿病**的靶向內分泌細胞方案。

技術路線

研究結果

（1）Mettl3PKO小鼠早期糖尿病發病及胰島形成障礙

為了研究Mettl3介導的m6A mRNA甲基化是否參與胰腺發育，將Mettl3flox / flox小鼠與Pdx1 -Cre小鼠雜交，獲得胰腺Mettl3基因敲除小鼠( Mettl3pKO ) (圖1A)。免疫染色結果顯示，Mettl3蛋白在E11.5 Mettl3pKO 胰腺芽的Pdx1+胰腺上皮細胞中選擇性缺失(圖1B)。作者發現大部分( ~ 81% ) E11.5 Mettl3pKO Pdx1+胰腺細胞中Mettl3表達缺失(圖1C)，這表明在胰腺早期**形成過程中，重組是非常有效的。此外，從E15.5 Mettl3pKO 胚胎胰腺中提取的總RNA的m6A水平降低( p = 0.051 ) （比色法檢測m6A整體甲基化水平）(圖1D)，表明Mettl3的缺失降低了E15.5 Mettl3pKO 的m6A RNA甲基化水平。

Mettl3PKO小鼠出生時符合預期的me孟德爾比例，在出生后8周內體重與年齡匹配的WT ( Mettl3flox / flox )和雜合子( Pdx1-cre；Mettl3flox/w ,命名為Mettl3pHET)相比沒有差異(圖1E )。在出生時，Mettl3pKO 小鼠的隨機血糖水平與WT對照和雜合子相當(圖1F )；然而，突變體在2周齡時隨機血糖水平開始**升高，并且具有嚴重的***( ~ 30mmol / L ) (圖1F )。此外，2周齡Mettl3pKO 小鼠血漿胰島素水平降低了65.1 % ( p < 0.05 ) (圖1G )，表明這些糖尿病突變體，β細胞衰竭占主導地位。

出生時，Mettl3pKO 小鼠的胰腺重量和大小都**降低(圖1H , 1I)，而WT和Mettl3p KO小鼠在E13.5和E15.5的胰腺重量沒有變化 (圖1J , 1K)。在P0時，作者觀察到amylase+細胞面積減少了52 %(圖2A , 2B)。此外，腺泡面積的減少主要歸因于腺泡細胞增殖的缺陷：在突變體胰腺中觀察到Ki67 + Amylase +細胞的比例減少了近一半。突變體和野生型胰腺組織中Caspase3陽性胰腺細胞的凋亡率無明顯變化。組織學分析還顯示新生Mettl3pKO胰腺的胰島質量減少了近50% ( p < 0.001 ) (圖2C )，包括胰島大小(圖2D )和切片數量的減少(圖2E )。這些結果表明，新生兒胰島的形成需要Mettl3介導的m6A甲基化

（2）mettl3的缺失改變了胰腺內分泌細胞的譜系決定

作者對P0胰腺進行了內分泌**(胰島素-β、胰***素-α、生長抑素-δ和胰多肽- PP)的免疫染色，結果發現突變胰腺β細胞數百分比**降低(圖2F、2G)。與此同時，α細胞、δ細胞以及PP細胞也減少了(圖2G ,附圖2B)。相反，Mettl3pKO胰腺中細胞角蛋白19 (CK19)陽性導管細胞**增加( p < 0.001 )，并伴有輕度擴張的(圖2H , 2I)，但未檢測到明顯的囊腫形成。以上數據表明，Mettl3介導的m6A甲基化影響了胰腺發育過程中胰腺的組成。

為了確定Mettl3的缺失在哪個時間點影響胰腺細胞系，作者檢測了E13.5和E15.5時Mettl3pKO和WT胰腺中Ngn3+和Sox9+染色的胰腺上皮細胞的數量(圖3A )。在E13.5階段，我們沒有發現Ngn3+和Sox9+細胞數量的變化 (圖3B , 3C)。相反，在E15.5期，突變體胚胎胰腺上皮中Ngn3+細胞數量**減少(圖3D )，Sox9+細胞數量**增加(圖3E )。作者還發現在E15.5 Mettl3pKO胰腺中內分泌特異性轉錄因子Ngn3，Nkx2.2和Nkx6.1的表達降低，而Ngn3的負調控因子Hes1的mRNA表達增加(圖3F )。與此同時，E15.5 Mettl3pKO胰腺切片中Nkx2.2或Nkx6.1陽性細胞的數量與同卵胰腺相比**減少(圖3F ,附圖3C , 3D)。相反，局限于后期導管細胞的HnfIβ的mRNA表達在E15.5 Mettl3pKO的胰腺中異常增加常增加(圖3F)。然而，Ptfla的mRNA表達和控制前胰腺細胞標志物cpa1染色的細胞比率卻在E15.5  Mettl3pKO胰腺中異常增加(圖3F)。

胰腺尖腺細胞的分化保持不變(圖3F,補充圖3C、3D)。這些結果表明，Mett13的缺失并不影響E15.5期胰腺尖突細胞的分化。在E15.5期Pal+細胞中缺失Mett13會延緩內分泌祖細胞系的形成，但會觸發Sox9+祖細胞的分化。

（3）對E15.5 Mettl3PKO胰腺細胞進行單細胞RNA測序

為了研究Mett13缺失后胰腺細胞命運決定的分子機制，我們對WT和Mettl3pKO小鼠的E15.5胚胎胰腺細胞進行了單細胞RNA測序scRNA (圖4A)，對11049個WT細胞和10928個Mettl3pKO細胞進行了測序，發現了16種轉錄獨特的亞型(圖4B)。我們根據已知標記物的表達,即β細胞中Ins1、α細胞中Gcg、內分泌祖細胞中Neurog3、干細胞（也稱為雙能祖細胞）中Spp1或尖突細胞中Cpa1的表達（圖4C），以及間質、間皮細胞、內皮細胞、免疫細胞、血管細胞和神經元細胞的表達，確定了預期的群體（圖4C)。發現內分泌系細胞，包括內分泌祖細胞和內分泌細胞減少（圖4D）。

然后，作者對數據集中的內分泌細胞譜系進行了亞聚類(圖4E )，根據胚胎胰腺假性時間分析確定了11個有效的簇，包括β細胞簇，δ細胞簇，2個α細胞簇，3個內分泌祖細胞簇，4個雙能細胞簇和3個未定義的小團簇(圖4E , 4F和附圖4A)。根據Ngn3、Chgb 和Fev的表達，內分泌祖細胞（EP)可進一步分為3個亞群（EP_early、EP_mid 和EP_late) (圖4F，附圖4A)。定量分析顯示，突變體中的EP、β、α和δ細胞均**減少(圖4G)。根據不同的細胞命運分離和調控特征，鑒定出四個雙能祖細胞(BP)群,其中BP_early 1、 BP_early 2和BP_mid細胞**較早的發育階段，而BP_late細胞被認為是發育軌跡上的內分泌祖細胞的前體(附圖4A，4B)。值得注意的是，檢測到BP_late細胞的不適當積累(523 vs 388, Mettl3pKO vs  WT) (圖4G) 。上述數據表明，Mett13的缺失阻礙了雙能祖細胞在E15.5晚期向內分泌祖細胞的轉變。

作者比較了WT小鼠和Mettl3pKO小鼠BP_late細胞的基因表達（圖4H 和 4I)。對BP_late亞群的GO分析顯示，Mettl3pKO中高表達的基因與上皮細胞遷移的正調控、胚胎上皮管形成和細胞遷移的正調控有關，而下調的基因則富集在與氧化磷酸化、ATP代謝過程、糖代謝和內分泌胰腺發育相關的GO條目中(圖4H )。

有趣的是，Wnt信號通路(被稱為內分泌分化抑制劑），而在下調的條目中發現了Wnt信號通路的負調控作用(圖4H )。Mettl3基因的缺失導致BP _ late簇中與內分泌分化相關的重要基因表達量降低，即Nkx6.1，Hdac1，Nr5a2和Kcnq1(圖4I )。相反，參與早期上皮細胞分化和上皮管形成的基因( Onecut2，Nr2f2，Sox4，Sox11，Wnt4，Hnf1β等)**上調(圖4I )。值得注意的是，SOX4對于正常的內分泌胰腺發育也至關重要。

（4）在E15.5 Mettl3PKO胰腺中確定Hdac1為m6A靶基因

為了鑒定改變的轉錄本是否存在m6A修飾，作者進一步對E15.5 WT和Mettl3pKO胰腺細胞進行了m6A MeRIP-seq。在WT和Mettl3pKO中分別發現了1288個共有峰以及9228個和2653個特異峰(圖5A)。其中與WT相比，Mettl3pKO發現了1241個高甲基化和6543個低甲基化m6A峰(圖5A)。m6A MeRIP-seq數據表明，絕大多數m6A峰分布在轉錄本的CDS和3’UTR(圖5B)，而Mettl3pKO的m6A峰密度主要在CDS區域降低（圖5C)。WT組和Mettl3pKO組**性motif分析為GGACU和DGGACU[D=A/G/U] (圖5D)。甲基化基因轉錄本的差異表達分析表明，相比WT組，Mettl3缺失的胰腺細胞有1029個基因甲基化水平較高，有3985個水平較低（圖5E)。Pathway分析表明，在Mettl3缺失的胰腺細胞中，低甲基化轉錄本明顯富集在與年輕成熟型糖尿病(MODY)、胰島素信號通路、胰腺分泌相關的轉錄本中(圖5F)。

為了確定Mettl3介導的控制內分泌細胞系的m6A直接靶基因，作者比較了在WT和Mettl3pKO在Bp_late細胞中通過scRNA和m6A MeRIP-seq發現的優先變化的轉錄本，相關分析*終確定了m6A修飾水平下降，轉錄本水平也下調的轉錄本70個以及43個上調轉錄本的(圖5G)。值得注意的是，內分泌轉錄因子Nkx6.1和Kcnq1被下調，而參與胰腺導管形成的Hnf1B在Mettl3缺失后出現了不同程度的上調(圖5G)。在m6A介導的下調轉錄本中，我們注意到作為Wnt和Notch通路(37）上游抑制因子的Hdac1表達發生了變化(圖5H)。有趣的是，Hdac1 mRNA在雙能祖細胞中明顯下調，但在內分泌祖細胞中的表達水平相當(附圖5A、5B)。IGV可視化結果顯示，Hdac1轉錄本在WT的mRNA中m6A修飾豐富，但在敲除Mettl3后m6A峰減少(圖5H)。作者通過MeRIP-qPCR進一步證實，在E15.5 Mettl3pKO胰腺細胞中，Hdac1 mRNA上的m6A減少。此外，通過對P0胰腺進行RIP-qPCR檢測，發現Mettl3蛋白能與Hdac1 mRNA相互作用(圖5J)。

眾所周知，mRNA轉錄本上的m6A修飾可能會影響mRNA的穩定性和翻譯。作者隨后解剖了E13.5完整胚胎胰腺芽，并用ShMettl3慢病毒或對照病毒處理48小時，以評估Mettl3對Hdac1表達的直接影響。作者發現在胚胎胰腺中敲除Mett13 48小時后，Hdac1的蛋白豐度**下降(圖5K)。在加入轉錄抑制劑ActD后，Sh Mettl3處理E13.5胰芽加速了Hdac1 mRNA的衰減，表明Mettl3的缺失直接降低了Hdac1 mRNA的穩定性(圖5L)。然后對E15.5WT和Mettl3pKO胚胎胰腺進行了Hdac1免疫熒光原位染色，發現Mettl3pKO小鼠Sox9+雙能祖細胞的Hdac1熒光強度明顯降低(圖5M)。同時Mettl3pKO小鼠胚胎胰腺細胞中，Wnt信號通路的**蛋白β-catenin和Notch信號通路的效應因子Hes1的表達同時上調(圖5N)。

（5）Mettl3/Hdac1通路控制內分泌譜系決定

為了解Hdac1是否介導了雙能主干內分泌祖細胞的分化，作者首先使用Hdac1抑制劑小白菊內酯或DMSO處理E13.5 WT胚胎胰腺2天。小白菊內酯不僅抑制了Hdac1的表達，還誘導了Wnt/β-catenin信號通路和Notch/Hes1信號的**(圖6A)。與此同時，用小白菊內酯抑制Hdac1活性48小時后，胚胎胰芽中Ngn3陽性細胞的數量明顯減少，但Sox9陽性細胞的數量卻增加了(圖6B和6C)。

然后，作者探討了在Mettl3pKO胚胎胰腺中恢復Hdac1的表達是否能挽救向內分泌細胞分化的障礙。作者解剖了E13.5 WT和Mettl3pKO胚胎胰腺芽，并在培養基中加入Hdac1激動劑ITSA-1或DMSO。培養2天后，作者發現ITSA-1處理可**增加WT胰腺芽中Hdac1的表達(圖6D）,而不會改變Wnt/β-catenin和Notch/Hes1信號轉導（圖6D）。ITSA-1處理也不影響WT胰腺芽中Ngn3+/m+細胞或So9+細胞的數量(圖6E-G)。重要的是，ITSA-1處理阻止了Wnt/β-catenin和Notch/Hes1信號的異常誘導(圖6D)，并挽救了Mettl3pKO胰腺芽中Ngn3+內分泌細胞和Ins+β細胞的減少以及Sox9+細胞的增加(圖6E-G)。以上數據有力地表明，Mettl3/Hdac1通路是胰腺發育過程中內分泌譜系決定所必需的。

全文小結

本研究發現胰腺祖細胞中METTL3的缺失會減少內分泌祖細胞池的大小以及出生后胰島的質量，并導致小鼠早發糖尿病。

METTL3缺失干擾了胰腺發育過程中雙能祖細胞向內分泌系或導管系分化的命運決定。

METTL3-HDAC1-WNT/NOTCH軸在體內和體外對內分泌細胞的形成至關重要。

云序生物m6A修飾研究五大模塊

01 m6A RNA修飾測序

m6A RNA修飾測序（m6A-MeRIP-seq）

對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

• m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

• m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

• m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

• m6A  mRNA測序

• m6A  miRNA測序

02檢測整體m6A修飾水平

比色法檢測整體RNA修飾水平

快速檢測m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選

m6A RNA修飾相關酶PCR芯片

尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗證

MeRIP-qPCR/GenSeq? MeRIP試劑盒

云序提供各類不同修飾的MeRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq? MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

05 機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq? RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

5.4 Ribo-seq

篩選翻譯水平發生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

5.5 SLAM-seq

篩選穩定性發生變化的RNA分子，研究相應的分子調控機制。

5.6 CHIRP-seq

篩選或驗證目標RNA與DNA互作，研究相應的分子機制。

云序生物服務優勢

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優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。

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