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云序生物客戶文章：ChIP-seq&mRNA-seq聯合應用
上海交通大學附屬瑞金醫院血液研究所趙維蒞教授團隊針對外周淋巴瘤的研究。近期，該課題組應用ChIP-seq聯合分析揭示了聯用西達本胺和地西他濱對組蛋白修飾基因突變的外周淋巴瘤的作用機制。該研究成果于月發表在血液科**雜志《Haematologica》（影響因子11.047）上。（ChIP-seq及mRNA-seq均由云序生物提供技術服務）
研究背景：由于不同的形態和免疫特征，約50%的外周淋巴瘤（PTCL）無法分類，并且呈現很差的臨床表現，因此迫切需要找到可操作性的生物標志物以便臨床上找到更好的治 療策略。已知表觀遺傳改變在腫 瘤發展中起到很關鍵的作用。組蛋白修飾，尤其是甲基化和乙?；?，一般都會參與調控染色體的狀態。在本研究中，作者首先通過靶向測序篩選到一系列組蛋白修飾相關基因的突變，接下來通過ChIP-seq和mRNA-seq進一步分析西達本胺和地西他濱聯用對組蛋白修飾基因突變的外周T淋巴瘤的作用機制。
研究思路：首先，作者篩選到了幾個關鍵基因的突變，比如組蛋白甲基化修飾相關的基因（KMT2D，SETD2，KMT2A和KDM6A）以及組蛋白乙?；揎椣嚓P的基因（EP300和CREBBP），并在125例患有PTCL患者中發現45例有59個體細胞突變。臨床研究發現組蛋白修飾相關基因突變與未經化療的患者更低的無進展生存期有關，且對組蛋白脫乙酰酶抑 制劑西達本胺敏感性增加。
1.外周T淋巴瘤突變情況統計
圖示：PTCL突變分類
2.組蛋白修飾基因突變使T淋巴瘤細胞對西達本胺和或地西他濱更敏感
KMT2D和EP300錯義突變質粒分別轉染至JurKat細胞，發現KMT2D突變會抑 制H3K4me3的表達水平，但會被組蛋白脫乙酰酶抑 制劑羅米地辛和西達本胺恢復。此外，EP300突變會抑 制H3K18ac的表達水平，但會被組蛋白脫乙酰酶抑 制劑丙戊酸，亞羅里亞胺酸或羅米地辛和西達本胺恢復。在PTCL腫 瘤樣本中也發現KMT2D突變明顯降低了核內H3K4me3的表達水平（30%），EP300/CREBBP突變也明顯降低了核內H3K18ac的表達水平（17%）。有趣的是，給突變患者按每周兩次口服30mg的西達本胺，有組蛋白修飾基因突變的復發患者得到完全或部分緩解。這一結果表明這些突變可能使PTCL患者對組蛋白脫乙酰酶抑 制劑更敏感。
圖示：組蛋白乙?；?制劑對KMT2D突變和EP300突變的PTCL的作用
體外實驗也進一步證實了這一結論。流式細胞術證明西達本胺和地西他濱可協同誘導KME2D突變的細胞凋亡作用和G0/G1期阻滯作用。在KMT2D突變的移植T淋巴瘤模型中，聯用西達本胺和地西他濱還能明顯延緩腫 瘤生長。體內外實驗一致表明聯用西達本胺和地西他濱比單用藥物作用更明顯。
圖示：西達本胺和地西他濱對KMT2D突變和EP300突變的PTCL的作用
3.ChIP-seq聯合mRNA-seq揭示作用機制
為了搞清楚KMT2D-H3K4me3 DNA結合的靶基因，作者利用ChIP-seq在單用西達本胺或聯用地西他濱的KMT2D突變細胞中檢測H3K4me3結合的靶基因。Venn圖表明聯合用藥和單用藥物中，H3K4me3結合的啟動子區域有明顯的非重疊區。有趣的是，只有聯用西達本胺和地西他濱才能影響H3K4me3結合的基因啟動子表達水平，這一結合域的motif富集在與PU.1結合的區域（激 活骨髓或B淋巴細胞的基因表達的轉錄因子）。mRNA-seq也表明與未處理組和單藥處理組相比，聯合用藥參與多種ai癥信號通路的調控，包括凋亡，細胞周期調控，細胞粘附和轉錄調控，而PU.1也參與ai癥信號通路和轉錄調控。作者進一步對聯合用藥組mRNA-seq和ChIP-seq中重疊的基因進行GSEA分析，結果發現聯合用藥使MAPK通路去活化，p-ERK也隨之上調。
圖示：ChIP-seq和mRNA-seq揭示西達本胺和地西他濱對KMT2D突變和EP300突變的PTCL的作用機制
參考文獻：
Histone modifier gene mutations in peripheral T-cell lymphoma not otherwise specified.
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