客戶文章|IF=10.6—甲狀腺*中m5C甲基轉移酶NSUN2通過維持tRNA的穩定性促進密碼子依賴性的致*翻譯

近日，中南大學湘雅醫院甲狀腺外科李新營教授團隊在國際**期刊《Clinical and Translational Medicine》（JCR Q1, IF=10.6）在線發表了題為“The m5C methyltransferase NSUN2 promotes codon-dependent oncogenic translation by stabilising tRNA in anaplastic thyroid cancer”（m5C甲基轉移酶NSUN2通過維持tRNA的穩定性促進密碼子依賴性的致*翻譯影響甲狀腺未分化*的進展）的原創性研究。云序生物有幸參與了該文章的m5C BS-seq、tRNA-seq、Ribo-seq等多項測序工作。

標題：“The m5 C methyltransferase NSUN2 promotes codon-dependent oncogenic translation by stabilising tRNA in anaplastic thyroid cancer”（m5C甲基轉移酶NSUN2通過維持tRNA的穩定性促進密碼子依賴性的致*翻譯影響甲狀腺未分化*的進展）

發表時間：2023年12月15日

發表期刊：Clinical and Translational Medicine

影響因子：IF=10.6/Q1

研究方法：RNA-seq、LC-MS、tRNA-seq、m5C BS-seq、Ribo-seq

文章鏈接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ctm2.1466

文章摘要

甲狀腺未分化*（ATC）是一種特殊甲狀腺*病理類型，極具侵襲性且目前尚無有效的**方式，致死率接近 100%。該研究證實NSUN2通過調節m5C修飾來維持tRNA的穩定性，促進ATC中的促*翻譯重編程。NSUN2在ATC中高表達并與**失分化相關，敲低NSUN2可抑制ATC細胞增殖和侵襲，NSUN2通過介導tRNA Leu-CAA和tRNA Leu-CAG 的m5C修飾，穩定相應tRNA的二級結構，進而加快c-Myc、BCL2、RAB31、JUNB和TRAF2促*翻譯效率，此外，NSUN2介導的m5C修飾水平在不同tRNA同位解碼器中的差異在一定程度上導致了密碼子依賴性翻譯偏倚。該研究結果不僅揭示了m5C甲基轉移酶NSUN2的促**活性，同時揭示了tRNA穩定性的動態控制及其下游*基因的表達，由此引發了下游密碼子依賴性致*翻譯網絡反應，從而促進了ATC細胞增殖和侵襲，為靶向**細胞的翻譯重編程、惡性轉化和耐藥提供了新的理論。

技術路線

研究結果

（1）NSUN2在ATC中上調，且促進ATC*癥進展

對四組甲狀腺*的RNA-seq數據進行分析發現，與甲狀腺**狀*（PTC）、低分化甲狀腺*（PDTC）或正常甲狀腺組織相比，ATC中NSUN2的mRNA**升高。與NSUN2low組相比，NSUN2high組中有幾個富集的通路，包括蛋白質水解、RNA代謝、細胞對DNA損傷刺激的反應、細胞周期和Rho GTPases的信號傳導。通過數據庫檢索發現，甲狀腺*患者NSUN2基因的突變譜顯示遺傳改變<0.2%，且NSUN2的高表達與PTC患者的總生存率**降低相關。提示NSUN2在關鍵細胞過程中的潛在調節作用及其與甲狀腺*侵襲性的關聯。作者通過對NSUN2在甲狀腺*患者中的表達進行驗證分析。發現NSUN2在ATC中**上調，也與細胞低分化狀態有關。

通過敲低及過表達NSUN2發現，NSUN2的敲低**抑制ATC細胞的增殖，削弱了細胞的侵襲和遷移能力，導致細胞周期阻滯。然而，NSUN2過表達使細胞增殖、集落形成、侵襲和遷移能力增強，促進了細胞周期的進展。綜上所述，說明NSUN2在體外ATC進展中的各種基本功能。

（2）ATC中NSUN2的抑制降低了細胞對化療藥物的耐受性

為了驗證NSUN2在ATC對化療藥物的耐受性中也起重要作用，作者測定了鹽酸阿霉素和順鉑在NSUN2敲低或過表達的*細胞中的半**抑制濃度（IC50）。結果發現，在NSUN2敲低細胞中，鹽酸阿霉素和順鉑的IC50值**降低，而在NSUN2過表達細胞中，鹽酸阿霉素和順鉑的IC50值升高。時間依賴性圖顯示，NSUN2敲低縮短了平臺期，提高了化療藥物的療效。在低劑量**下，NSUN2敲低降低了ATC細胞對順鉑或鹽酸阿霉素的耐受性。而當暴露于兩種化療藥物時，NSUN2過表達細胞的存活率**增加。以上結果表明，NSUN2可以促進細胞獲得耐藥性。因此，常規化療藥物聯合RNA胞嘧啶-5甲基化抑制劑可能提供有效的抗*策略。

（3）靶向NSUN2表達抑制ATC進展和體內耐藥

為了闡明NSUN2在體內ATC進展中的作用，作者建立了體外移植小鼠模型。結果發現注射shN細胞的小鼠的**生長速度明顯慢于注射載體的小鼠，且降低了體內ATC的增殖。在肺轉移小鼠模型中，心內注射NSUN2敲低和對照kkm -5 M，顯示shN ATC細胞發生較少的轉移結節，NSUN2敲低還減輕了ATC細胞對肺泡組織的破壞。在鹽酸阿霉素或順鉑**下，shN組**體積和重量明顯低于對照組。NSUN2敲低**提高了藥物療效。但值得注意的是，藥物**后，shN組的P53染色有所減輕。這種現象可能與凋亡誘導的細胞減少有關。因此，NSUN2的敲低降低了ATC細胞的增殖和轉移，而在兩種藥物的**下，ATC細胞的體內存活率進一步降低。

（4）NSUN2調控tRNA m5C的修飾，促進ATC的全局翻譯

用LC-MS檢測細胞m5C整體修飾水平，結果顯示，在shN細胞中tRNA的m5C修飾水平整體減少。通過m5C BS-seq發現，NSUN2敲低后，大多數tRNA的m5C水平大幅降低，已知的NSUN2底物中的幾個位點m5C修飾消失。此外，還發現甲基化水平的變化*有可能出現在可變環和TΨC臂上，表明它們對NSUN2敲低處理很敏感。通過嘌呤霉素攝入實驗，發現NSUN2敲低導致細胞系整體蛋白合成減少，且可通過過表達輕度挽救。這些結果進一步支持了tRNA m5C促進蛋白合成的作用，暗示NSUN2可能通過tRNA表觀遺傳修飾來調控翻譯進程。

（5）NSUN2調節促進ATC進展的促*mRNA的翻譯，且部分TE下調的**相關基因表現出密碼子使用偏倚

通過對對照組和shN細胞組的mRNA-seq和Ribo-seq發現，對照組與shN細胞組之間的差異表達轉錄本富集于內質網蛋白加工相關通路、**、細胞周期和TNF信號通路中的microRNA。NSUN2敲低**改變了ATC細胞中的基因翻譯水平，減少翻譯的基因與內質網蛋白質加工、自噬和內吞作用相關。通過對翻譯效率（TE）的分析發現，NSUN2敲低后，mRNA亞群的TE發生變化。其中，***00個基因富集于幾種*癥相關途徑，包括RNA代謝、翻譯、細胞應激反應調控和VEGFA-VEGFR信號通路，表明NSUN2在一個關鍵的促*程序中發揮作用。與ATC進展相關的候選基因的驗證發現，表明NSUN2促進了翻譯。有趣的是，NSUN2抑制降低了BCL2蛋白水平。NSUN2敲低降低了c-Myc的mRNA和TE水平。然而，mRNA水平的降低并不能解釋c-Myc的TE急劇下降。在ATC組織樣本中，與NSUN2低表達的組織樣本相比，盡管mRNA水平較低，但較高的NSUN2表達可以維持較高的蛋白表達。結果表明，致*的NSUN2調節對ATC抗凋亡和發育至關重要的mRNA亞群的翻譯。

作者又對TE**變化的基因的CDS序列密碼子使用特征進行了分析，發現密碼子使用偏向主要受進化過程中自然選擇的影響，TE上調基因和TE下調基因的RSCU值無明顯差異。作者還通過雙熒光素酶報告基因檢測發現NSUN2催化tRNA Leu-CAA的m5C修飾，并增強了UUG-rich mRNA的翻譯。tRNA Leu-CAA和Leu-CAG之間m5C甲基化的差異可以解釋35.7% UUG密碼子偏倚導致TE下調。

（6）敲除NSUN2基因逆轉了有害的c-Myc對NSUN2周期的影響

c-Myc是NSUN2的上游轉錄因子。研究表明，c-Myc有一個亮氨酸拉鏈二聚化結構域，這是有效的DNA結合所必需的，在這個結構域中，c-Myc基因上的大多數亮氨酸殘基由TTG編碼。該結構域的單個氨基酸替換會使N-myc基因產物的轉化能力失活，亮氨酸拉鏈結構的突變也會導致c-Myc的功能失活。c-Myc功能需要在其鋅指結構中正確翻譯TTG編碼的亮氨酸，這表明NSUN2敲低導致tRNA Leu-CAA中NSUN2介導的m5C早期減少，從而導致上游轉錄因子c-Myc中富含TTG的亮氨酸的翻譯受損。

（7）NSUN2介導的m5C修飾對tRNA的穩定性起作用

作者通過實驗發現，在NSUN2過表達的細胞中觀察到tRNA的穩定性增加。通過比較成熟tRNA Leu-CAA的完整序列和相關的裂解片段，并設計引物量化細胞中的tRNA產物發現，NSUN2的敲低降低了tRNA的Leu-CAA儲備，增加了3 ' -tRF片段。然而，在8305C細胞中，NSUN2過表達阻止了tRNA的切割。對這些可能的片段在tRNA Leu-CAA上的切割位點進行了評估發現，m5C的缺失可能導致裂解酶對tRNA位點的可及性增加，類似于血管生成素切割反密碼子環的機制。tRNA-seq進一步證實了m5C修飾與tRNA表達水平之間的相關性。NSUN2敲低后，少量甲基化的tRNA Leu-CAA 4-1表達仍然升高，而其他m5C缺失的tRNA Leu-CAA表達則下降。此外，tRNA表達與m5C水平呈正相關，這些數據支持tRNA m5C修飾與tRNA穩定性之間的聯系。

全文總結

• NSUN2基因在ATC中表達量上調，且促進了ATC*癥的進展

• 在ATC中，敲除NSUN2降低了細胞對化療藥物鹽酸阿霉素和順鉑的耐受性，常規化療藥物聯合RNA胞嘧啶-5甲基化抑制劑可能提供有效的抗*策略

• 敲除NSUN2降低了ATC細胞的增殖和轉移，而在兩種藥物的**下，ATC細胞的體內存活率進一步降低

• NSUN2可調控tRNA的m5C修飾來調控翻譯進程，可通過過表達輕度挽救

• NSUN2調節促進ATC進展的促*mRNA的翻譯，且部分TE下調的**相關基因表現出密碼子使用偏倚

• NSUN2敲低導致tRNA Leu-CAA中NSUN2介導的m5C早期減少，從而導致上游轉錄因子c-Myc中富含TTG的亮氨酸的翻譯受損

• NSUN2介導的m5C修飾對tRNA的穩定性起作用

該研究結果不僅揭示了m5C甲基轉移酶NSUN2的促**活性，同時揭示了tRNA穩定性的動態控制及其下游*基因的表達，由此引發了下游密碼子依賴性致*翻譯網絡反應，從而促進了ATC細胞增殖和侵襲，為靶向**細胞的翻譯重編程、惡性轉化和耐藥提供了新的理論。

云序生物m5C修飾研究五大模塊

01 m5C RNA修飾測序

對m5C RNA甲基化，云序可提供mRNA和多種非編碼RNA測序：

m5C-MeRIP-seq

m5C-BS-seq

02檢測整體m5C RNA修飾水平

LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平

**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。

比色法檢測整體RNA修飾水平

快速檢測m5C整體甲基化水平

03 m5C RNA修飾上游酶的篩選

m5C RNA修飾相關酶PCR芯片

尋找上游直接調控m5C RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m5C RNA修飾靶基因驗證

MeRIP-qPCR/GenSeq? MeRIP試劑盒

云序提供各類不同修飾的MeRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq? MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

05機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq? RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

云序生物服務優勢

優勢一：云序累計支持客戶發表100 +篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子1000 +

優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。

優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

優勢四：**提供m6A一站式服務：m5C整體水平檢測、m5C測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。

優勢五：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。

優勢六：國內*全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化、假尿嘧啶等修飾的測序技術。

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