技術干貨| eccDNA測序后續應該怎么驗證？云序帶你一探究竟！

eccDNA近年來一直是科研的熱點，目前已有眾多研究發現eccDNA在衰老、**、耐藥、凋亡等方面的強大調控功能，eccDNA的產生機制、作用機理正在不斷的被探索！ eccDNA測序技術也逐漸成熟，新的測序方法、數據庫等不斷涌現。而一般在研究過程中，我們進行了高通量測序以后，還需要進行一些對應的低通量驗證實驗才能更好地驗證實驗數據的真實性！

那eccDNA驗證實驗有哪些？每一步又該怎么設計？驗證結果又該怎么看呢？

云序生物為助力您完成eccDNA的后續驗證，設計了詳細的“eccDNA后續驗證方案”供參考，接下來就跟著我們一起來看看具體的驗證方案吧！

第一步：驗證 eccDNA的表達量（qPCR）

樣品：進行 qPCR 實驗時樣品量*少需要三個重復，即3 VS 3。

（1）選取 eccDNA

根據 eccDNA 測序報告中的差異表達譜，選取 10~20個與研究方向相關且差異表達的 eccDNA（即一組表達量比較高，另一組表達量為 0或者比較低這種差異很大的eccDNA）。

（2）qPCR 驗證

通過 eccDNA qPCR 實驗，在各組測序樣品（或與測序樣品同樣處理的樣品）中驗證這些 eccDNA 的真實表達水平。

（3）eccDNA初篩

根據qPCR 結果，挑選出處理組與對照組間表達量存在**差異的 eccDNA。

*注：eccDNA 測序識別方式是通過識別環上**的 junction 位點，且測序過程中是隨機片段化，所以測序結果中處理組eccDNA比較高，對照組 eccDNA 表達量為 0，并不表示樣本中該 eccDNA 的真實表達量一定為 0！因此需要進行定量 PCR 的驗證，驗證eccDNA的真實表達水平?。?！

#結果示例#

根據eccDNA堿基序列，設計反向引物（eccDNA引物設計教程），并進行qPCR。

定量PCR溶解曲線及Ct值（例圖）

第二步：驗證環狀結構（sanger 測序+電泳鑒定）

樣品：選擇qPCR結果中信號*強的且組間差異**的1個eccDNA進行環狀結構的驗證。

（1）sanger 測序

選取第一步qPCR篩選出來的eccDNA，將覆蓋eccDNA連接位點的 PCR 擴增產物進行sanger測序，檢測環狀連接位點，以驗證該eccDNA確實具有環狀結構。

（2）中間產物電泳鑒定

可針對基因組DNA、富集后的eccDNA、滾環擴增后的eccDNA和無模板參照（NTA）等類型中間產物，進行目標eccDNA的凝膠電泳實驗，可進一步證實 eccDNA的存在。

*注：高通量測序數據量較大，分析識別過程可能會存在一定噪聲和誤差，或者存在一些非特異性信號。因此，需要通過sanger測序和電泳鑒定證實篩選出的eccDNA結果的準確性！

#結果示例#

根據eccDNA堿基序列，設計反向引物（eccDNA引物設計教程），并進行PCR擴增，接著將覆蓋eccDNA連接位點的PCR擴增產物進行sanger測序。eccDNA長度跨度200bp-20kb，驗證率超過80%！

Circle-Seq和Sanger測序結果比較（例圖）

[來自TIAM1和PKNOX1基因的eccDNA連接位點前后15bp PCR產物測序結果。

黑色（上）：表示基于Circle-Seq得到的eccDNA連接序列；

藍色（下）：表示基于Sanger測序結果的eccDNA準確環狀位點；

陰影（紅色）序列：表示連接位點]

采用outward和inward兩種方式進行引物設計（eccDNA引物設計教程），并進行相應的outward PCR和inward PCR，然后將PCR產物跑膠，觀察膠圖結果。

中間產物電泳引物設計原理圖（例圖）

inward擴增引物不包含junction位點，在基因組DNA和eccDNA中均能擴增出產物；而outward擴增引物包含junction位點，在基因組中擴增出的產物不**，所以膠圖條帶是彌散的，而在富集后的eccDNA中能擴增出大量的eccDNA，所以條帶較清晰明亮。

中間產物電泳鑒定結果圖

第三步：擴大樣品量驗證 eccDNA biomaker（qPCR）

如果您是想要研究eccDNA生物標志物，還需要進行“第三步擴大樣品量后的eccDNA驗證”，詳情如下：

樣品：研究biomaker對樣品量有一定要求，*少需要30以上的樣品量，即處理組 VS 對照（30 vs 30）。

eccDNA biomaker 驗證：

選取qPCR中表達差異且已驗證出環狀結構的 eccDNA，進行 eccDNA biomaker 的定量 PCR 驗證。通過大批量樣品驗證，發現 eccDNA 在處理組中呈現出差異表達，就可以證實其具有可以作為biomaker的潛力。

*注：處理組和對照組間差異表達的 eccDNA，并不一定是實驗處理導致的，可能是小批量小鼠個體間差異引起的，也可能是由于實驗處理導致一些細胞死亡，存活下來的細胞中 eccDNA 豐度增加，但實際 eccDNA 的表達并未受實驗處理而發生增加或減少。因此通過大批量的驗證，可以消除個體差異或其他因素產生的噪音。

云序生物可提供以上eccDNA qPCR、sanger測序、中間產物電泳鑒定等后續驗證實驗！

云序生物eccDNA測序

云序生物是國內率先提供環狀DNA測序服務的公司，早在2018年已啟動了環狀DNA測序技術的開發。2019年，云序發布了組織細胞環狀 DNA 測序（circle-seq），并成為A&A Bio**代理（該品牌的環狀 DNA 純化柱被絕大部分環狀DNA高分文章采用）。2020年，云序又相繼發布了體液樣品環狀DNA測序及體液樣品環狀DNA甲基化測序服務，擁有豐富的環狀DNA測序產品線。云序生物環狀DNA測序采用雙端測序，上機測序數據量24G。迄今為止，我們已經完成上千例樣品的環狀DNA測序，積累了豐富的項目經驗，樣品類型涵蓋：組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等，物種涵蓋：人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。 2021年，云序生物的客戶發表國內首批 eccDNA 研究論文，其中更有發表于 Nature Communications 上的高分研究。

云序生物eccDNA相關產品

組織細胞環狀 DNA 測序

體液樣品環狀 DNA 測序

體液樣品環狀 DNA 甲基化測序

環狀 DNA Sanger 測序驗證

環狀DNA定量PCR

A&A Biotechnology 環狀 DNA 純化柱

1.組織細胞環狀DNA測序

云序生物基于circle-seq的方法，采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號，高效地純化和富集環狀DNA，再利用NGS測序和生信分析識別環狀DNA。結合優化的實驗流程，本環狀DNA測序服務具有檢出率高﹑準確性好等優點。

技術優勢：

• 使用原裝A&A Biotechnology純化柱高效富集環狀DNA

• 滾環擴增放大環狀DNA信號，提高檢出率

• 專業的生信分析：詳盡的注釋、豐富的圖表

云序生物組織細胞樣品eccDNA測序實驗示意圖

2.體液樣品環狀DNA測序

針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品，云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開eccDNA環狀結構并同時在DNA片段兩端加上接頭，進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高，損耗低，實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量，使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。

技術優勢：

• 減少DNA損失

• 保留原始表達量，不同環狀DNA間表達量比較更準確

3.體液樣品環狀DNA甲基化測序
針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品，云序參考盧煜明教授團隊 2021 年研發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開環狀DNA環狀結構并同時在DNA片段兩端加上接頭，并用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U，進行建庫及測序。一次建庫測序中同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化位點的信息。

云序生物體液樣品eccDNA測序實驗示意圖

技術優勢：

• 一箭雙雕：同時檢測環狀DNA及其甲基化狀況，節約樣品，性價比高

• 單堿基分辨的環狀DNA甲基化分析

  
  

4.環狀DNA sanger測序

針對測序項目中篩選出的環狀DNA，云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。其主要目的在于：為用戶提供一種低成本的擴大樣品量驗證手段，節約實驗成本。通過設計反向引物進行PCR擴增，將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序，驗證連接位點處序列。

5.A&A Biotechnology 環狀 DNA 純化柱

A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分環狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內的**總代理。

云序生物服務優勢

優勢一：國內率先提供環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序的公司，同時也是較早有客戶發表 10 分以上 eccDNA 論文的公司。

優勢二：擁有包括組織細胞/體液樣品環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序在內豐富的環狀DNA測序產品線。

優勢三： A&A Biotechnology 總代理，采用原裝A&A Bio純化柱，環狀DNA 純化效果好。

優勢四：一站式服務：您只需按照送樣要求向云序生物寄送樣品，我們就能為您完成從環狀DNA 提取，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。 

優勢五：嚴格質控流程：云序生物質控流程嚴格，層層把關，為客戶提供高準確度的結果。

優勢六：專業化生物信息分析：云序生物強大生物信息團隊，滿足客戶個性化數據分析要求。

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