云序客戶| MeRIP-seq+RIP-seq技術揭示 m6A 甲基化調控BMSCs成骨分化新機制

骨骼的尺寸和形狀在整個生命過程中被精確建模和重塑，以確保骨骼的結構和完整性。骨髓間充質干細胞( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs )的成骨分化及其機制是骨形成和骨重建的重要問題。BMSCs的分化缺陷和功能障礙會導致年齡相關的變化和疾病，如肌肉減少癥和骨質疏松癥，BMSCs也被認為是促進骨再生**的相關靶點。

迄今為止，在mRNA、tRNA、rRNA、核小RNA ( snRNA )、核仁小RNA ( snoRNA )和長鏈非編碼RNA ( lncRNA )中已經鑒定出170多種RNA修飾類型。其中，N6-甲基腺苷( m6A )是哺乳動物細胞中*普遍的 mRNA 修飾。它被m6A甲基轉移酶、去甲基化酶動態沉積和去除，并被m6A特異性結合蛋白識別。盡管m6A參與了包括BMSC分化在內的多種生物學過程，但其在BMSC成骨分化過程中的確切作用和機制仍需進一步闡明。

2021年11月21日，云序客戶上海交通大學醫學院附屬新華醫院張曉玲團隊在《Cell Death Disease》以“The m6A “reader” YTHDF1 promotes osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells through translational control of ZNF839”為題發表論文，通過m6A MeRIP-seq、RIP-seq（云序生物提供）等測序技術揭示了m6A閱讀蛋白YTHDF1通過調控ZNF839翻譯，增強骨髓間充質干細胞BMSC成骨機制，為骨質疏松癥的防治提供了新的思路。

標題：The m6A “reader” YTHDF1 promotes osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells through translational control of ZNF839（ m6A 閱讀蛋白YTHDF1調控ZNF839 翻譯促進骨髓間充質干細胞成骨）

發表時間：2021年11月21日

發表期刊：Cell Death Disease

影響因子：IF=9.2/Q1

研究方法： m6A MeRIP-seq、RIP-seq

文章鏈接： https://www.nature.com/articles/s41419-021-04312-4

研究摘要

N6 -甲基腺苷( m6A )是人骨髓間充質干細胞( hBMSCs )分化所必需的。然而，其內在機制在很大程度上是未知的。為了明確m6A結合蛋白YTHDF1在hBMSCs體內成骨中的可能作用，我本研究通過構建Ythdf1 KO小鼠，發現敲除Ythdf1會導致體內骨量下降。在小鼠BMSCs中敲除Ythdf1和在hBMSCs中敲低YTHDF1均抑制了細胞的體外成骨分化。通過m6A MeRIP-seq、RIP-seq，作者發現ZNF839 (一種鋅指蛋白)是YTHDF1的一個靶基因。研究還驗證了其在小鼠中的同源蛋白Zfp839受Ythdf1的m6A依賴的翻譯調控。Zfp839通過與Runx2相互作用并進一步增強Runx2的轉錄活性來增強BMSC的成骨能力。這些發現將提高對BMSC成骨調控機制的認識，為骨質疏松癥的預防和**提供新的思路。

技術路線

研究結果

（1）YTHDF1與骨質疏松癥有關，在人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）成骨分化過程中表達增加

為了了解m6A在hBMSC成骨和骨質疏松癥中的可能作用，作者通過RT-PCR檢測了三名年輕健康男性個體（年齡范圍：24-29歲，平均：26.7歲）和三名老年骨質疏松癥男性患者（年齡范圍：71-77歲，平均：74.8歲）獲得的hBMSCs中m6A調節酶的mRNA水平。與其他m6A調節酶相比，YTHDF1 mRNA的水平隨著年齡的增長而**降低（圖1A）。然后，作者進一步將樣本數量擴大到每組9例（年齡范圍：20-30歲，平均：26.4歲）VS（年齡范圍：70-80歲，平均：75.2歲），并證實了兩組之間YTHDF1 mRNA水平的**差異（圖1B）。這些結果表明YTHDF1可能參與了骨質疏松癥的發病機制。

然后作者測定了在成骨培養基中培養的hBMSCs中YTHDF1的mRNA表達譜。在成骨分化過程中，YTHDF1 mRNA表達顯示出與堿性磷酸酶（ALP）相似但更早的分布。YTHDF1 mRNA水平增加，并在第3天達到峰值，然后略有下降，直到第14天。同時，細胞ALP表達升高，其峰值出現在第7天，略微落后于YTHDF1。ALP mRNA水平在第10天逐漸降低，并在第14天進一步略有下降（圖1C, D）。這些數據表明YTHDF1基因在hBMSC成骨分化過程中以時間依賴性方式表達。

作者進一步觀察了Ythdf1在Ythdf1基因敲除（KO）小鼠BMSCs譜系分配和骨代謝中的潛在作用。Ythdf1 KO小鼠是存活的，并且在12周齡時，與對照同窩出生小鼠相比具有相似的大?。▓D1E）。WB分析證實了Ythdf1 KO小鼠來源的BMSCs中Ythdf1的成功缺失以及野生型（WT）小鼠來源的BMSCs中成骨期間Ythdf1蛋白表達的增加（圖1F）。對脛骨干骺端骨小梁進行微計算機斷層掃描（μCT）分析顯示，Ythdf1 KO小鼠總骨密度（BMD）低于WT小鼠（圖1G），骨小梁體積與總體積比（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）的減小進一步證明了這一點，而Ythdf1 KO小鼠的骨小梁分離度（Tb.Sp）更高（圖1H）。除了小梁表型外，與 WT 小鼠相比，Ythdf1 KO 小鼠還表現出皮質骨厚度（Ct.Th）輕度降低。

（2）YTHDF1參與hBMSCs成骨分化

為了確定YTHDF1在hBMSC成骨分化中的作用，作者在hBMSCs中進行了功能喪失/獲得實驗。使用shRNAs抑制YTHDF1表達，作者評估了三種shRNAs的敲除效率，并且在后續實驗中使用了具有**效率的YTHDF1-shRNA3（圖2A，B）。成骨誘導后72小時后，YTHDF1敲除導致hBMSCs中RUNX2、OSTERIX、ALP和骨鈣素（OCN）的mRNA表達有限降低（圖2C）。與對照組相比，敲除YTHDF1的hBMSCs中ALP和茜素紅染色（ARS）強度減弱（圖2D）。將pLVX-YTHDF1轉染到培養的hBMSCs中實現YTHDF1過表達，并且在轉染后72小時通過PCR和WB驗證了YTHDF1 mRNA和蛋白質表達水平的升高（圖2E，F）。在pLVX-YTHDF1轉染后24小時，hBMSCs被誘導成為成骨細胞，與對照組相比，轉染pLVX-YTHDF1的細胞ALP和ARS強度更強，并在成骨誘導72小時后，成骨細胞特異性基因的mRNA水平**升高（圖2G，H）。

（3）MeRIP-Seq和RIP-Seq鑒定ZNF839為YTHDF1下游靶點

對成骨誘導3天的hBMSCs和未處理的對照細胞進行m6A MeRIP-seq分析，以探索未處理的hBMSCs中m6A修飾的概況以及成骨過程中m6A在hBMSCs中的變化。通過成骨誘導組和對照組m6A MeRIP-seq，共檢測到13815和16657個m6A峰，分別對應8012和8729個轉錄本。作者通過motif分析，發現*常見的m6A位點GGAC序列，在m6A峰中**富集（誘導組p<1.7 e-10，對照細胞p<3.2e-11）（圖3A）。為了證實m6A在轉錄物中的優先定位，作者進行了mRNA中m6A峰的相對位置的分析，發現m6A峰特別富集在3′-UTR區域的終止密碼子附近（圖3C）?？紤]到m6A的動態調節在成骨分化過程中起作用，只有成骨過程中豐度發生改變的m6A峰被認為是真正的m6A峰。共檢測到2303個基因發生了差異甲基化（p<0.00001），并對其進行了進一步研究。

作者通過m6A MeRIP-seq方法鑒定了所有發生修飾的mRNAs，但沒有鑒定與YTHDF1結合的mRNAs。因此進一步通過RIP-Seq，以獲得與YTHDF1結合的mRNAs，從而進一步識別其直接靶標。在該試驗中使用YTHDF1基因敲除細胞，與YTHDF1結合親和力降低的基因成為研究對象。在RIP-Seq中總共檢測到534個在sh-YTHDF1下調的基因。為了深入了解這些與YTHDF1結合的基因的潛在功能，作者對這些發生m6A修飾且與YTHDF1結合的mRNAs進行了GO分析，觀察到它們參與多種功能，包括細胞分化調控、成骨細胞分化調控和骨礦化調控（圖3D，E），表明這些基因可能參與hBMSC成骨分化。共從m6A MeRIP-seq和RIP-Seq結果的交集獲得132個基因（圖3D）。在去除異常值后，作者選擇了***個相對高表達的基因：FOXD2、JDP2、LRRC32、DRAM1、ZNF839、SLC7A5、THBS1、ZSCAN2、BCR和HK2。ZNF839是YTHDF1識別的m6A修飾增加*多的基因，并且它在其翻譯終止密碼子附近具有高度富集和特異性的m6A峰（圖3F）。作者還發現ZNF839及其小鼠同源物Zfp839是鋅指蛋白，在全身組織中普遍表達，并在骨髓中高度表達（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55778）?；谝陨闲畔?，作者推測ZNF839是一個與YTHDF1結合的m6A修飾基因，并在hBMSC成骨的調節中發揮作用，因此需要進一步研究。

（4）m6A“閱讀蛋白”Ythdf1與Zfp839結合并促進帶有m6A修飾的Zfp839 mRNA的翻譯

作者進一步研究Zfp839是否受Ythdf1調控。在成骨3天后，評估對照組和Ythdf1 KO組BMSCs中Zfp839的mRNA和蛋白表達水平。通過WB檢測到Ythdf1 KO組BMSCs中Zfp839蛋白水平的下調。相反，與對照組相比，BMSCs中Ythdf1的過表達顯示出更高的Zfp839蛋白水平，盡管Zfp839的mRNA水平基本保持不變（圖4A、B）。這些結果表明Ythdf1對Zfp839的調控發生在轉錄后。

然后，作者試圖證實Zfp839的表達受Ythdf1以m6A依賴的方式調節。首先，作者使用哺乳動物m6A位點預測因子SRAMP搜索Zfp839中的m6A基序。用SRAMP程序對Zfp839 mRNA的分析預測了CDS上288、1067、1901、1673、2314、2542位點的6個高置信度m6A位點，以及773和779位點的2個非常高置信度m6A位點。為了進一步研究，作者同時在兩個非常高的m6A位點（Zfp839-Mut）引入了同義突變（圖4C）。

作者進行了m6A抗體的下拉實驗，但與Zfp839-WT的細胞相比，未能從Zfp839-MT m6A的C3H10T1/2細胞下拉m6A突變的Zfp839 mRNA，表明Zfp839 mRNA中m6A修飾幾乎完全缺失（圖4D）。作者試圖證實帶有m6A修飾的Zfp839 mRNA是否可以被m6A“閱讀器”Ythdf1識別和結合。為此，通過Ythdf1和Zfp839-WT/MT共轉染C3H10T1/2細胞，并使用抗Ythdf1抗體進行RIP實驗。結果表明，在共表達Ythdf1和Zfp839-WT的C3H10T1/2細胞中檢測到Zfp839 mRNA，但在共表達Ythdf1和Zfp839-MT的細胞中沒有檢測到（圖4E）。這些結果表明Ythdf1與Zfp839 mRNA的結合應該是m6A依賴性的。

為了驗證Ythdf1的成骨促進功能是否通過Zfp839翻譯增強來實現，作者敲除了過表達Ythdf1的BMSCs中Zfp839的表達。事先檢測了Zfp839 shRNAs的轉染效率。shRNA1**降低了Zfp839 mRNA和蛋白質水平，而shRNA2和shRNA3沒有顯示出這種**的效果（圖S2A，B）。因此作者使用shRNA1進行了以下研究。ALP和茜素紅染色顯示，由Ythdf1過表達引起的小鼠BMSC成骨增強可通過敲低Zfp839消除（圖4F）。用成骨特異性基因進行的PCR也顯示了與染色試驗相似的結果（圖4G）。所有這些實驗都證實了Ythdf1對BMSC成骨的作用是由其下游靶標Zfp839介導的。

為了進一步研究體內Ythdf1和Zfp839的關系，作者在WT和Ythdf1 KO小鼠的骨髓切片中進行了免疫染色。在WT組中檢測到Ythdf1和Zfp839共定位，而在Ythdf1 KO組中幾乎沒有檢測到，這表明Ythdf1和Zfp839可能在體內可能存在表達和功能上的相關性（圖S3A）。

（5）Zfp839與Runx2相互作用促進BMSCs成骨

雖然作者證實了Ythdf1的成骨功能，以Zfp839作為其下游靶點，但Zfp839在BMSCs成骨分化中的確切作用仍有待闡明。作者進一步進行了功能獲得和喪失實驗，以確定Zfp839對成骨細胞分化的影響。將Zfp839 shRNA轉染的小鼠BMSCs與成骨培養基培養3天，敲除Zfp839**消除了成骨誘導下BMSCs中成骨特異性基因mRNA水平表達的增加（圖5A）。ALP和茜素紅染色測定的結果也表明敲除Zfp839降低了這些BMSCs的礦化作用（圖5B）。通過將pLVX-Zfp839轉染到小鼠BMSC中實現Zfp839過表達。在pLVX-Zfp839轉染后72小時，通過PCR和WB驗證轉染效率（圖S4A，B）。與敲除實驗相反，pLVXZfp839轉染的Zfp839過表達增強了BMSC成骨分化，成骨細胞基因表達的升高以及ALP和茜素紅染色強度的增強都證明了這一點（圖S4C，D）。所有這些結果都表明Zfp839在BMSC成骨中起著積極的作用。

作者發現在功能喪失/獲得實驗中，Zfp839過表達或敲除輕微影響Runx2的表達，但在BMSC成骨分化過程中強烈改變其下游成骨特異性基因（Alp、Osterix和Ocn）的表達。鑒于Runx2是在BMSC成骨過程中上調其下游成骨特異性基因的上游關鍵轉錄因子，這些結果促使作者推測Zfp839可能作為Runx2的輔助**因子來增強其轉錄活性，而不是作為直接促進Runx2表達的上游因子。

此外，通過將Flag標記的Zfp839或Myc標記的Runx2共轉染到HEK-293T細胞中來進行IP實驗，然后提取蛋白質并用抗Myc或抗Flag抗體進行IP。如圖5C所示，Zfp839可以直接與Runx2交互。此外，IP分析表明內源性Zfp839可以與MC3T3-E1細胞中的Runx2相互作用（圖5D）。

作者進一步構建了含有成骨細胞特異性基因啟動子區的報告質粒，并將這些質粒與Runx2共轉染到293個T細胞中。熒光素酶報告基因分析表明，Zfp839單獨的過表達不影響熒光素酶活性。單獨Runx2的過表達**了Alp、Osterix和Ocn啟動子。然而，當Zfp839與Runx2共轉染時，Runx2的轉錄活性**增強，如在Alp、Osterix和Ocn啟動子下熒光素酶活性**增加所示（圖5E）。為了研究Zfp839和Runx2在骨髓間充質干細胞成骨過程中的作用，作者還對誘導成骨72小時的骨髓間充質干細胞進行了免疫熒光染色。與對照細胞相比，Zfp839和Runx2在成骨誘導的BMSCs中的熒光強度增強，這表明Zfp839和Runx2可能是參與成骨的BMSCs細胞核**定位的同一調節復合物的一部分（圖5F）?？傊?，這些數據表明Zfp839通過與Runx2相互作用來調節成骨細胞特異性基因表達。

（6）YTHDF1缺失導致體內骨量降低

為了進一步驗證 Ythdf1 在體內骨代謝中的作用，作者發現 Ythdf1 KO 小鼠的礦物質沉積率（MAR）和骨形成率（BFR）都比 WT 對照組小鼠低（圖 6A），這表明 Ythdf1 KO 小鼠的骨形成率低于 WT 對照組。

此外，作者還在蘇木精和伊紅（H&E）染色（圖 6B）中檢測到骨量減少，并在 Ythdf1 KO 小鼠的免疫組化切片中檢測到Ⅰ型α-1鏈膠原蛋白（Col1a1）的減少（圖 6C）。此外，還進行了耐酒石酸磷酸酶（TRAP）染色，發現兩組的染色面積量化沒有**差異（圖 6D），表明 Ythdf1 不影響破骨細胞的活性和骨吸收。此外，免疫熒光檢測在 KO 組幾乎檢測不到 Ythdf1 的表達，Zfp839 的表達也有所降低（圖 6E、F）。這些體內結果也表明，骨形成的遲緩可能是由于缺乏 Ythdf1 的 BMSCs 成骨分化能力減弱所致。

全文小結

• 本研究表明YTHDF1在hBMSC成骨分化中起著關鍵作用。其敲除減少了體外hBMSCs的成骨。在體內，Ythdf1 KO小鼠與它們的WT同窩出生小鼠相比顯示出骨量減少。

• 本研究發現ZNF839為YTHDF1的下游靶標。ALP和ARS測定以及PCR分析結果表明，Zfp839可以增強BMSC成骨。

• 本研究通過IP實驗和熒光素酶測定結果證實了Zfp839與Runx2的物理相互作用以及下游成骨特異性基因啟動子熒光素酶活性的增加，表明Zfp839 可以作為 Runx2 的共**劑增強BMSC成骨。

本研究發現鋅指蛋白ZNF839/Zfp839由Ythdf1以m6A依賴的方式進行轉錄后調控。同時發現它作為一種新的輔**因子，通過與主轉錄因子Runx2相互作用來增強BMSC成骨。這些發現為深入剖析BMSC成骨的分子機制提供了新的途徑，并為代謝性骨病的**提供了潛在的靶點。

云序生物m6A修飾研究五大模塊

01 m6A RNA修飾測序

m6A RNA修飾測序（m6A-MeRIP-seq）

對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

• m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

• m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

• m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

• m6A  mRNA測序

• m6A  miRNA測序

02檢測整體m6A RNA修飾水平

LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平

**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。

比色法檢測整體RNA修飾水平

快速檢測m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選

m6A RNA修飾相關酶PCR芯片

尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗證

MeRIP-qPCR/GenSeq? MeRIP試劑盒

云序提供各類不同修飾的MeRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq? MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

05機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq? RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

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