“真”**定量RNA測序重磅來襲??！

轉錄組為特定細胞在某一功能狀態下轉錄出來的所有RNA，主要包括mRNA，某些情況下也包括非編碼RNA。轉錄組測序利用高通量測序技術，快速且**地揭示某一物種特定細胞或組織在某一狀態下的幾乎所有轉錄本信息，包括轉錄本表達量、可變剪接體、可變polyA位點等。

轉錄組分析的**目標是準確定量樣品中RNA轉錄本的豐度。目前，基于測序的方法（如RNA-Seq）具有消除基因之間雜交偏差的優勢，但在RNA測序過程中，實驗操作、逆轉錄、加接頭、儀器等及PCR過程中存在的序列擴增偏好性等因素，都會使得常規RNA-Seq的結果準確度下降。

那怎樣實現RNA-seq的準確定量呢？

2012年PNAS報道了一種可以降低RNA-Seq偏倚和噪音的方法，也是我們常說的UMI-RNA-Seq。下面讓我們了解一下UMI是如何發揮作用的。

什么是UMI-RNA-Seq？

RNA測序在構建文庫時，需要進行PCR擴增，但是所有的片段并非以同等速率進行擴增，片段的長度、GC含量及濃度等都會影響擴增速率，*終導致容易擴增的片段被極大的富集，而一些含量較低或堿基偏好較低的片段富集很少，甚至丟失，從而影響測序結果的準確性。

UMI-RNA-Seq實驗原理是通過在每個cDNA分子上連接一個特異序列標簽（UMI，Unique Molecular Identifier），隨后這些UMI會隨cDNA序列一起擴增。在測序完成后，通過識別UMI，將具有相同UMI的重復片段合并，去除由于PCR擴增偏好性及測序儀引起的重復，達到一比一還原樣本擴增前的原始狀態，從而定量原始樣本中轉錄本的數量。

UMI≠**定量測序！

與常規轉錄組測序相比，添加UMI標簽，轉錄本測序定量的準確性確實能夠實現大幅提高，但通過UMI-RNA-Seq就能真正的實現**定量測序嗎？

根據上述UMI-RNA-Seq的原理，可以發現UMI標簽能夠很好的消除文庫構建過程中PCR擴增及測序儀引起的偏好性和重復性。但在測序過程中，除了PCR擴增過程中產生的干擾，逆轉錄、加接頭、上機量等實驗過程中存在的問題以及數據量的差異也會影響RNA的定量，*終導致轉錄組測序準確性下降。因此**通過UMI標簽不能完全消除這些差異，也無法實現RNA的準確定量。

另外，對于多個樣本的RNA-seq數據，通常還會利用組間的數據進行差異分析。差異分析的前提是每個樣本的獲得的原始數據量是相等的，而數據量的矯正*通過UMI技術是很難實現的。因此，盡管添加了UMI標簽，一些差異也無法消除，無法實現真正的**定量。

云序生物UMI + spike-in矯正實現“真”**定量RNA測序??！

為了彌補UMI-RNA-Seq方法無法消除的干擾問題，云序生物聯合UMI與spike in矯正共同實現對轉錄組測序的**定量！

Spike in是一種標準物，也稱為外源性內標，是指在每個樣品中加入等量的已知序列信息的非親緣標準品基因組，與實驗樣品共同進行文庫構建及測序。在進行分析時，通過不同樣本間spike in的表達量，能夠非常準確地對不同樣本之間RNA的表達量進行矯正，消除樣本間的由于實驗操作及數據量引起的誤差，很好的彌補了UMI無法消除的偏差，從而實現測序高準確性定量。

圖注：使用spike in矯正前后數據的可視化

圖：spike in的優勢，From K.C et al. 2016

（a）當基因組各處都發生相同程度的變化時，將總測序reads歸一化為相同的數字會隱藏變化，而將spike-in的reads歸一化為相同的數字會揭示reads密度的全局變化。

(b)當特定基因組區域發生信號增加時，標準化樣本之間的總測序reads會導致來自基因組其他區域的reads數量人為減少，這就會錯誤地解釋為在特定實驗條件下減少。而通過使用spike-in的reads作為標準化，可以避免這種人為的變化。

(c)甲基化DNA拷貝數的差異在使用spike-in標準化下可以被準確的分析，而樣本中甲基化的比例在沒有spike-in標準化下也可以正確分析。

**定量測序技術在MeRIP-Seq中的應用

Spike in除了能夠進行數據的矯正之外，還能應用于MeRIP-seq中的實驗質控環節。MeRIP-Seq是基于特異性抗體進行的免疫沉淀實驗，抗體的選擇是通過多項研究證明的有效性高、特異性好的抗體。但是一些客戶可能還是會對抗體的有效性及MeRIP實驗的可靠性有質疑。針對這種情況，云序生物提供MeRIP-seq實驗中的spike in驗證：通過在不同樣品中添加等量的具有/不具有RNA修飾的非親緣標準品基因組，驗證實驗的可靠性。

圖注：基于spike in的數據質控

（左：帶有修飾的spike in；右：不帶修飾的spike in）

目前，在云序生物m6A修飾的相關測序服務中已經**添加spike in，對于其他RNA修飾，如m5C、m7G、ac4C、m1A等，云序生物也可提供spike in的添加，為客戶提供數據有效性的保障?。ň唧w咨詢相關銷售）

云序生物“真”**定量RNA測序技術適用范圍及優勢

云序生物**定量RNA測序技術（UMI+spike in）適用于全轉錄組測序、mRNA測序、LncRNA測序、circRNA測序等多種轉錄組測序，同時也適用于多種RNA修飾的MeRIP測序（m6A、m5C、ac4C和m7G等）。

技術優勢1. 測序結果更準確！

云序生物通過在文庫構建時加入UMI標簽以及spike-in共同矯正測序偏差，得到測序結果更準確！

技術優勢2. 差異分析更可信！

云序生物通過**定量測序對不同樣本間RNA表達量進行高準確性矯正，使得不同樣本差異比較更可信，同時可以無偏差應用于不同樣本。

技術優勢3. 測序結果更穩定！

云序生物通過**定量測序可以更好的減少樣品用量以及技術誤差等影響，使得測序結果更穩定。

云序生物服務優勢

優勢一：云序累計支持客戶發表100+篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子 1000+。

優勢二：累計完成上萬例RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。

優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

優勢四：**提供m6A一站式服務：m6A RNA修飾整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down、Ribo-seq、CHIP-seq等技術服務。

優勢五：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。

優勢六：國內*全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?、2'-O-甲基化測序和假尿嘧啶修飾測序。

云序客戶RNA修飾部分文章列表

相關產品

m6A RNA甲基化測序

m5C RNA甲基化測序

m1A RNA甲基化測序

m7G RNA甲基化測序

ac4C RNA乙?；瘻y序

O8G RNA氧化修飾測序

2’-O-RNA甲基化測序

m6Am RNA甲基化測序

RNA pulldown

RIP測序

CHIP測序

Ribo-seq（核糖體印跡測序）

RNA修飾文章往期回顧

1區，IF=27| 云序m6A MeRIP-seq助力鱗狀細胞*機制研究！

用戶文章 1區 lncRNA m6A甲基化測序助力人脂肪干細胞成骨分化的調控機制研究

客戶文章|1區，IF=9.995|m6A甲基化測序助力宮頸*相關HPV病毒研究

用戶文章IF=19.568|m5C修飾測序助力NSUN2調控病毒I型干擾素反應的機制研究

Nature 新發現：線粒體 m5C 修飾竟是**轉移的元兇！

用戶文章IF=14.9 1區：ac4C乙?；{節人胚胎干細胞的自我更新

云序用戶農口IF20+論文：植物mRNA存在ac4C新型修飾，對RNA穩定性及翻譯產生重要影響

用戶文章：m7G 甲基化參與調節心肌細胞增殖|新型RNA修飾研究

客戶文章|新型RNA修飾之m7G揭示急性髓系白血病發病機制

云序用戶植物文章6連發：植物當中各類RNA甲基化測序該怎么發?

慶祝云序用戶m1A、m6A、m5C RNA甲基化測序文章三連發

上海云序生物科技有限公司

Shanghai Cloud-seq Biotech Co.， Ltd.

地址：上海市松江區莘磚公路518號18號樓2樓

電話：021-64878766

網址：www.cccppp1.com