云序客戶m6A高分文章|揭示組蛋白乙?；cm6A修飾在眼部黑色素瘤發生中的共同作用機制

組蛋白乙?；腔蛘{控的重要表觀遺傳標記，n6 - methylladenine (m6A) RNA修飾也是最常見的RNA修飾，盡管人們對組蛋白乙?；蚼6A修飾在**發生調控中的作用進行了大量的研究，但目前對這兩種基本修飾之間的相互作用缺乏**的了解。

2023年7月19日，云序生物客戶：上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院眼科范先群院士、賈仁兵教授、柴佩韋博士為文章通訊作者，莊艾等為**作者，以“Targeting histone deacetylase suppresses tumor growth through eliciting METTL14-modified m?A RNA methylation in ocular melanoma”為題在《Cancer Communication (Lond)》雜志發表研究論文，該研究以黑色素瘤細胞和正常黑色素細胞系為對象，通過m6A MeRIP-seq、RNA-seq、CUT&Tag、單細胞測序等多組學分析。揭示HDACis通過協調m?A修飾來發揮**作用，從而揭示眼部黑色素瘤中HDAC/METTL14/FAT4表觀遺傳級聯的“組蛋白-RNA互作”反應。

發表期刊：Cancer Communications

影響因子：16.2  Q1

發表時間：2023年7月19日

研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、CUT&Tag、單細胞測序

文章鏈接：Targeting histone deacetylase suppresses tumor growth through eliciting METTL14-modified m?A RNA methylation in ocular melanoma

技術路線

材料方法

•  葡萄膜黑色素瘤細胞（MEL290，OMM2.3和OMM1）

• 人結膜黑色素瘤細胞（CRMM1，CRMM2和CM2005.1）

• 葡萄膜黑色素瘤細胞系MUM2B

• 葡萄膜黑色素瘤細胞系92.1

• 人視網膜色素上皮細胞系ARPE-19

• 皮膚黑色素瘤細胞系（A375和SK28）

• 正常人黑色素細胞系PIG1

全文摘要

首先進行組蛋白修飾抑制劑HDACis對眼部黑色素瘤的抑制作用研究。使用Dot blot法檢測整體m?A RNA修飾水平。

利用RNA-seq、CUT&Tag、單細胞測序、甲基化RNA免疫沉淀測序（m6A MeRIP-seq）和m?A單核苷酸分辨交聯和免疫沉淀測序(miCLIP-seq)，以揭示HDACis對眼部黑色素瘤中甲基轉移酶（METTL14）和FAT**抑制同源物4（FAT4）的作用機制。

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）、western blotting和免疫熒光染色法檢測METTL14和FAT4在眼黑色素瘤細胞和組織中的表達。

建立細胞模型和異種原位移植 (Orthotopic Xenograft) **模型以鑒定METTL14和FAT4在眼部黑色素瘤生長中的作用。

采用RIP-qPCR、m6A MeRIP-seq、miCLIP-seq和RNA穩定性實驗來研究FAT4對m?A水平的作用機制。

研究結果

1、HDACis對眼部黑色素瘤具有**選擇性攻擊作用

為了分析表觀遺傳藥物的臨床潛力，本研究對245種表觀藥物進行了高通量抑制劑庫篩選。經過**輪篩選和第二輪驗證，篩選驗證結果揭示三種組蛋白去乙?；种苿?HDACis) 表現出**選擇性抑制，選擇性指數>5，分別是LBH589、RG2833和LMK-235。在3個HDACis中，LBH589在眼部黑色素瘤細胞中表現出**的選擇性指數（>10）和**的IC50值。表明LBH589在**眼部黑色素瘤方面表現出高效和低毒性。

為了驗證LBH589在體內誘導的抑制作用，通過帶有熒光素酶標簽的92.1細胞建立了眼部黑色素瘤異種原位移植**模型。動物成像顯示，與對照組相比，LBH589處理組表現出生物發光信號和**體積均降低。表明LBH589在體外和體外選擇性地抑制眼部黑色素瘤。

2、HDAC通過誘導METTL14表達**m?A修飾

為分析LBH589的下游靶標，研究對LBH589處理的92.1細胞進行高通量轉錄組分析（RNA-seq），RNA-seq數據顯示，2841個基因表達上調，2086個基因表達下調。下調基因主要富集在細胞周期、細胞分裂和DNA復制過程中，支持在眼部黑色素瘤中觀察到的LBH589誘導的抑制表型。大多數上調基因（1776/2841，62.5%）表現出差異m?A甲基化水平（m6A MeRIP-seq和miCLIP-seq數據），表明HDAC抑制可能調控整體m?A甲基化模式。隨后利用dot blot法檢測整體m?A甲基化水平，結果揭示黑色素瘤細胞中的m?A甲基化水平低于正常黑色素細胞，這與黑色素瘤中的其他m?A發現一致。研究發現經LBH589處理后，眼部黑色素瘤細胞中的整體m?A甲基化增加，表明HDAC抑制可恢復眼部黑色素瘤中m?A甲基化水平。

隨后，作者探索了LBH589誘導m?A甲基化**的分子機制。對m?A相關修飾酶包括writer蛋白（METTL3、METTL14和WTAP）、eraser蛋白（ALKBH5和FTO）和reader蛋白（YTHDF1-3）的RNA-seq數據進行分析。分析結果表明，METTL14在LBH589處理的黑色素瘤細胞中**增加，其他與m?A相關的修飾酶保持不變。且METTL14在mRNA和蛋白水平上均被**。這些數據表明HDAC抑制誘導了METTL14的**上調，導致眼部黑色素瘤中整體m?A甲基化水平的**。

3、METTL14在眼部黑色素瘤中低乙?；?/span>

由于METTL14參與LBH589介導的m?A**，作者分析了眼部黑色素瘤中的METTL14乙?；癄顟B和表達水平。結果揭示了與正常色素細胞相比，眼部黑色素瘤細胞在METTL14啟動子中表現出降低的H3K27Ac和H3K9Ac豐度。且HDAC抑制進一步增加了眼黑色素瘤細胞中METTL14的H3K27Ac和H3K9Ac水平。研究結果表明METTL14在眼部黑色素瘤中低乙?；?，但這種低乙?；梢酝ㄟ^HDAC抑制來回復。

4、FAT4是METTL14的下游標靶基因

作者研究了METTL14在眼部黑色素瘤中的抑*作用機制。使用多組分析鑒定了三個符合以下標準的基因（CRYBG3、FAT4、SEMA3D）：在METTL14過表達后上調（藍色圓圈，GSE215095）、在LBH589處理后上調（棕色圓圈，GSE214457），與TCGA隊列中的METTL14呈正相關（紅色圓圈，R>0.3，P<0.05），且在m?A修飾水平低的**中下調（綠色圓圈，GSE176345）（黃色圓圈，GSE137675）。在這三個基因中，只有FAT4表現出預后價值，且在TCGA隊列中與METTL14平行表達（R=0.471，P<0.001）。如RNA-seq可視化圖所示，METTL14過表達和LBH589處理后，FAT4表達**增加。且FAT4表達由LBH589處理誘導，在RNA和蛋白水平上與METTL14表達正相關?？傊?，研究結果表明FAT4可能參與METTL14介導的眼部黑色素瘤的**抑制。

5、FAT4在眼部黑色素瘤中的抑*作用

盡管FAT4在許多**中是一種傳統的抑*因子，但其在眼部黑色素瘤中的功能仍然是個謎。本研究檢測了眼部黑色素瘤樣品和細胞系中的FAT4表達。與METTL14類似，眼部黑色素瘤臨床樣本中的FAT4水平**降低，與復發率降低相關。FAT4的RNA和蛋白水平在眼部黑色素瘤細胞系中也降低。為了評估FAT4在METTL14介導的**抑制中的作用，作者在METTL14過表達的眼部黑色素瘤細胞系中沉默FAT4表達，結果表明FAT4敲除減弱了METTL14介導的**抑制，包括細胞聚落形成能力和轉移能力。在異種原位移植**模型中，FAT4沉默消除了METTL14過表達誘導的**抑制?？傊?，這些結果表明FAT4參與了由METTL14介導的眼部黑色素瘤抑制網絡。

6、YTHDF1識別m?A修飾增強了FAT4的RNA穩定性

由于METTL14是m?A修飾的甲基化轉移酶（writer），作者研究了METTL14是否以m?A修飾依賴性方式調控FAT4表達。利用miCLIP-seq（圖6A）和m6A MeRIP-seq（圖6B）分析結果發現，眼黑色素瘤細胞系中的FAT4發生了低甲基化，與這些細胞中METTL14低水平表達一致。此外RIP分析發現FAT4在眼部黑色素瘤細胞中m?A**低甲基化。外源性METTL14表達進一步增加了FAT4的m?A甲基化水平?？偟膩碚f，這些數據表明，METTL14負責催化FAT4 mRNA的m?A甲基化。

由于YTHDF家族蛋白負責識別m6A甲基化，而m6A甲基化在決定其RNA命運中發揮著重要作用，因此我們探究了這些“Reader”在FAT4調控中的作用。利用RIP-PCR，我們發現FAT4 mRNA在正常黑素細胞和mettl14過表達的眼部黑素瘤細胞中都特異性地與YTHDF1結合，而在其他reader蛋白(YTHDF2和3)與FAT4 mRNA之間觀察到微弱的相互作用信號(圖6C)。因此，沉默YTHDF1**抑制了FAT4的表達，而在ythdf2 /3沉默的細胞中FAT4的表達保持不變(圖6D)。有趣的是，外源性METTL14表達增加了FAT4 mRNA的穩定性，這與METTL14過表達細胞中FAT4表達的升高有關(圖6E，紫色)。此外，YTHDF1的沉默**削弱了FAT4 RNA的穩定性(圖6E，棕色)，并破壞了mettl14介導的功能(圖6E，綠色)。有趣的是，FAT4與YTHDF1**正相關(R = 0.359, P <0.001)。

全文總結

 研究結果首先表明了眼部黑色素瘤細胞對HDACis的易感性。HDACis觸發眼黑色素瘤中m?A RNA修飾的升高。進一步的研究表明，METTL14是HDACis的下游候選基因。METTL14在組蛋白低乙?；癄顟B下沉默，而HDACi恢復了METTL14的正常組蛋白乙?；?，從而誘導其表達。隨后，METTL14通過m?A-YTH N?-甲基腺苷RNA結合蛋白1依賴性方式促進**抑制因子FAT4表達，從而發揮**抑制作用?？傊?，本文揭示了HDACi恢復METTL14的組蛋白乙?；?，并隨后在**發生過程中調控METTL14介導的m?A修飾。

這些結果表明，HDACis通過協調m?A修飾發揮**作用，揭示了眼黑色素瘤中HDAC/METTL14/FAT4表觀遺傳級聯的“組蛋白-RNA互作”。

 云序生物m6A修飾研究五大模塊

01 m6A RNA修飾測序

m6A RNA修飾測序（m6A-meRIP-seq）

對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

m6A  mRNA測序

m6A  miRNA測序

02 檢測整體m6A RNA修飾水平

LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平

**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。

比色法檢測整體RNA修飾水平

快速檢測m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選

m6A RNA修飾相關酶PCR芯片

尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗證

MeRIP-qPCR/GenSeq? MeRIP試劑盒

云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq? MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

05 機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq? RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

云序生物服務優勢

優勢一：云序累計支持客戶發表100 +篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子1000 +

優勢二：累計完成上萬例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。

優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

優勢四：提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。

優勢五：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。

優勢六：國內較全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化、假尿嘧啶RNA測序。

相關產品

m6A RNA甲基化測序

m5C RNA甲基化測序

m1A RNA甲基化測序

m7G RNA甲基化測序

ac4C RNA乙?；瘻y序

O8G RNA氧化修飾測序

2’-O-RNA甲基化測序

假尿嘧啶RNA測序

m6Am RNA甲基化測序

RNA pulldown

RNA-seq

RIP測序

往期回顧

客戶文章| Nature子刊 揭示了FMR1通過m6A修飾調控早期胚胎發育的分子機制

用戶文章m6A專題|IF=9.8|m6A去甲基化酶ALKBH5缺乏會加重鈷致神經退行性損傷

1區，IF=27| 云序m6A MeRIP-seq助力鱗狀細胞*機制研究！

用戶文章 1區 lncRNA m6A甲基化測序助力人脂肪干細胞成骨分化的調控機制研究

客戶文章|1區，IF=9.995|m6A甲基化測序助力宮頸*相關HPV病毒研究

用戶文章IF=19.568|m5C修飾測序助力NSUN2調控病毒I型干擾素反應的機制研究

Nature 新發現：線粒體 m5C 修飾竟是**轉移的元兇！

用戶文章IF=14.9 1區：ac4C乙?；{節人胚胎干細胞的自我更新

云序用戶農口IF20+論文：植物mRNA存在ac4C新型修飾，對RNA穩定性及翻譯產生重要影響

用戶文章：m7G 甲基化參與調節心肌細胞增殖|新型RNA修飾研究

客戶文章|新型RNA修飾之m7G揭示急性髓系白血病發病機制

云序用戶植物文章6連發：植物當中各類RNA甲基化測序該怎么發?

慶祝云序用戶m1A、m6A、m5C RNA甲基化測序文章三連發