用戶文章IF=14.9 1區：ac4C乙?；{節人胚胎干細胞的自我更新

ac4C RNA乙?；窃赗NA ac4C修飾酶的作用下，使N4位乙酰胞嘧啶發生乙?；囊环N保守的化學修飾（N4-acetylcytidine）。早期研究發現該修飾存在于真核生物中絲氨酸及亮氨酸tRNA和18S rRNA上，導致Watson-Crick堿基熱穩定性增加，調控蛋白合成中的編碼準確性；近期研究發現ac4C分布在人類轉錄組中，大多數位點出現在編碼序列（CDS）內，并且通過改善mRNA的穩定性和翻譯促進靶基因表達。NAT10催化的ac4C通過促進mRNA的穩定性，成為編碼轉錄組中一個重要的轉錄后調節因子。然而，它在哺乳動物發育中的作用尚不清楚。
云序客戶北京大學基礎醫學科學院李揚科研團隊通過云序生物提供的acRIP-seq、LC-MS/MS等技術，發現**多能性調節因子OCT4是人胚胎干細胞（hESC）自我更新維持過程中獨特且**的NAT10應答的ac4C修飾靶基因，揭示了NAT10在維持hESC自我更新中的作用。該研究成果以“NAT10-mediated N4-acetylcytidine mRNA modification regulates self-renewal in human embryonic stem cells”為題發表在《Nucleic Acids Research》雜志上。

論文題目：NAT10-mediated N4-acetylcytidine mRNA modification regulates self-renewal in human embryonic stem cells
發表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：14.9/Q1
發表時間：2023年7月27日
期刊ISSN：0305-1048
研究方法：acRIP-seq、acRIP-qPCR、LC-MS/MS等

1、高通量測序顯示ac4C修飾在hESC轉錄組中普遍存在
作者通過acRIP-seq定位了ac4C修飾在野生型（WT）hESC上的位置，觀察到ac4C峰在編碼序列（CDS）中富集，也有相當一部分會在3’-UTRs中富集。在具有ac4C修飾的mRNA中，我們觀察到編碼**多能性調節因子OCT4（POU5F1）、SOX2和NANOG的mRNA始終被ac4C修飾，此外，還檢測到其他與多能性相關的基因轉錄本具有ac4C修飾。

2、乙酰轉移酶NAT10的表達與多能性呈正相關
為了了解ac4C修飾在多能性維持中的作用，作者重點研究了NAT10，這是人類中**已知的ac4C乙酰轉移酶，其表達水平直接影響ac4C在RNA上的形成。作者首先研究了NAT10在人類早期胚胎發育過程中的表達模式，發現NAT10在外胚層中高表達，但在三胚層發育過程中表達**下調。隨后通過EB（胚狀體）形成進行自發分化實驗，發現在自發分化過程中，mRNA和蛋白水平上NAT10的表達**下降，與OCT4的表達趨勢相似。定向分化檢測顯示在早期分化過程中NAT10和OCT4下調，分化標志物SOX1和SOX17在mRNA和蛋白水平上均上調。

3、NAT10的擾動會損害hESC的自我更新，并促進hESC的早期分化
作者構建了NAT10 KD hESCs(RNAi敲低NAT10）和sh control hESCs（shRNA 慢病毒對照）兩種類型細胞，在相同條件下培養后，KD細胞比sh對照細胞表現出更少、更小的菌落，增值效率也**降低。用Western blot和RT-qPCR方法檢測多能性標記物和發育調控因子的基因表達，相比于sh control hESCs，NAT10 KD hESCs顯示**多能性調節因子OCT4、NANOG、SOX2的表達減少，而三胚層的發育調節因子表達增加。為了更**地分析NAT10敲低導致的hESCs基因表達的改變，作者對NAT10 KD和sh control的hESCs進行了高通量RNA測序，結果顯示，NAT10基因的敲除導致2455個基因表達下調，1548個基因表達上調。對NAT10 KD hESCs中下調的差異表達基因（DEGs）的GO-BP功能富集分析顯示，部分基因在多細胞生物信號通路、第二信號通路介導的信號通路和多種信號通路中富集。對NAT10 KD hESCs中上調的DEGs進行分析，顯示出與形態發生、發育和分化相關的**功能，如腎臟形態發生、內胚層發育和內胚層細胞分化。綜上所述，結果表明NAT10敲除的干擾損害了hESCs的自我更新，并促進了早期分化。

4、過表達NAT10可促進hESC的自我更新
作者生成過表達細胞系（NAT10 OE hESCs），以研究NAT10在hESCs中是否為自我更新的調節因子。實驗結果顯示，NAT10 OE hESCs與對照組保持相同未分化形態，NAT10 OE hESCs的增殖率明顯高于對照hESCs。對NAT10過表達組和對照組中**多能標記物的Western blot檢測結果發現，在NAT10 OE hESCs中OCT4和SOX2的表達**增加，而NANOG的表達沒有明顯改變。這些數據顯示NAT10的過表達有助于促進hESCs的自我更新。

5、NAT10缺失導致靶基因上的ac4C缺失
研究在轉錄組規模上NAT10缺失對ac4C修飾的影響，作者對NAT10 KD hESCs進行了acRIP-seq實驗，比較NAT10 KD hESCs與WT hESCs的ac4C峰和靶基因，在NAT10 KD hESCs中，ac4C乙?；宓梅挚傮w降低。作者又進行了基于NaCNBH3的化學ac4C測序，以消除假陽性，兩種方法聯合分析鑒定出476個NAT10應答的ac4C靶基因，熱圖還顯示，在NAT10 KD的hESCs中，這些NAT10應答的ac4C靶基因的乙?；?*降低。這些靶基因的GO-BP功能富集分析突出了幾個功能組，如有絲分裂核分裂、DNA復制、細胞周期正調控、mRNA穩定性調控、干細胞群體維持和內胚層發育等，并且在這476個對NAT10應答的ac4C靶基因中，觀察到了兩個**多能性調控因子，即OCT4和SOX2。

通過LC-MS/MS評估了WT和NAT10 KD hESCs的總RNA和mRNA中ac4C修飾水平。發現在hESCs中，mRNA上存在大量的ac4C修飾，與WT hESCs相比，NAT10 KD hESCs的ac4C豐度在總RNA和mRNA中都**降低。這些結果表明，NAT10催化的ac4C乙?；饕植荚趍RNA上，這可能與hESC的細胞周期、mRNA穩定性和自我更新有關。

6、排除tRNA和rRNA的ac4C修飾對hESC自我更新的影響
tRNA ac4C乙?；惨蕾囉陉P鍵蛋白輔助因子THUMPD1。為了進一步研究排除tRNA ac4C乙?；瘜ESCs自我更新的重要貢獻，作者通過CRISPR/Cas9靶向THUMPD1位點，構建了THUMPD1敲除（KO）的hESCs。形態學圖像顯示，THUMPD1 KO hESCs與對照組hESCs之間的細胞形態沒有**差異，并且兩種hESCs形成的菌落數量也沒有明顯差異，說明THUMPD1敲除對hESCs的增殖率沒有**影響。通過Western blot檢測THUMPD1 KO hESCs和對照組中OCT4、SOX2和NANOG的蛋白水平，與對照組hESCs相比，THUMPD1 KO hESCs中OCT4和NANOG的表達沒有明顯變化。同樣，SNORD13是rRNA乙?；貏e需要的，作者利用CRISPR/Cas9構建了SNORD13敲除（KO）的hESCs，與前面所述結果相似，與對照組相比，SNORD13 KO hESCs的細胞形態、菌落數量無**差異，OCT4、SOX2和NANOG的表達也沒有明顯差異。上述結果說明rRNA和tRNA ac4C乙?；瘜ESCs的自我更新沒有產生**影響。

7、NAT10催化ac4C修飾靶向**多能性因子OCT4，調控其mRNA的穩定性
為了進一步驗證OCT4和SOX2的ac4C豐度，作者進行了acRIP-qPCR檢測，并以IgG作為同型對照。結果顯示，NAT10 KD細胞中OCT4的ac4C豐度明顯降低，而與Sh對照組相比，SOX2沒有明顯變化，這表明SOX2對NAT10應答的ac4C靶基因的置信度較低。對NAT10 KD和sh對照的hESCs的mRNA半衰期分析得出，NAT10的擾動可能導致mRNA穩定性的整體**下降，與sh對照相比，NAT10 KD中OCT4的半衰期下降***，SOX2沒有**下降。NAT10敲除后，OCT4 mRNA的穩定性**降低，而SOX2 mRNA的穩定性沒有**變化。綜上所述，這些結果表明**多能性相關基因OCT4是NAT10介導的ac4C修飾的**功能靶點，且NAT10維持了OCT4的mRNA穩定性和蛋白表達水平。

01 ac4C RNA修飾測序
ac4C RNA修飾測序
對ac4C RNA乙?；?，目前***的檢測手段為acRIP-seq技術，適用于ac4C RNA乙?；V研究，快速篩選ac4C RNA乙?；谢?。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的ac4C測序：
ac4C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
ac4C  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
ac4C  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
ac4C  mRNA測序
ac4C  rRNA測序
ac4C  circRNA測序
ac4C  tRNA測序

02 檢測整體ac4C RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
03 ac4C RNA修飾上游酶的篩選
ac4C RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控ac4C RNA乙?；募谆D移酶。
04 ac4C RNA修飾靶基因驗證
acRIP-qPCR
云序提供acRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證靶基因RNA修飾水平。
05 機制互作研究
RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
06 翻譯組
Ribo-seq（核糖體印記測序）
檢測轉錄本上核糖體的分布和翻譯活性，了解蛋白質表達情況以及翻譯過程。

優勢一：云序累計支持客戶發表百余篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子1000+, 其中RNA乙?；瘻y序有多達5篇影響因子接近20 分的高分論文。
優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：提供ac4C一站式服務：ac4C整體水平檢測、acRIP-seq、acRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull down等。
優勢五：率先研發超微量acRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內較全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。

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