云序客戶文章：ctDNA甲基化—用于復發性膠質母細胞瘤診斷與預后研究

膠質母細胞瘤( GBM )是一種生存率低、預后差、復發風險高的惡性**，開發有效的生物標志物監測原發性或復發性GBM，為患者提供及時**至關重要。

循環**DNA ( ctDNA )在**診斷和監測領域顯示出**的優勢和廣闊的應用前景。云序客戶首都醫科大學附屬北京朝陽醫院馬立新科研團隊通過云序生物提供的ctDNA甲基化測序、mRNA-seq等技術分析了腦脊液ctDNA甲基化譜和**組織轉錄譜，并結合CGGA和GEO數據庫進行分析，確定了8個hub基因用于復發性GBM的診斷和預后，為復發性GBM的臨床研究提供了新的生物標志物。該成果以 “Genome-wide methylation analysis of circulating tumor DNA: A new biomarker for recurrent glioblastom” 發表在Heliyon雜志上。

論文題目：Genome-wide methylation analysis of circulating tumor DNA: A new biomarker for recurrent glioblastom

發表期刊：Heliyon

影響因子：4.0/Q2

發表時間：2023年3月15日

期刊ISSN：2405-8440

研究方法：ctDNA甲基化測序、mRNA-seq 等

研究思路

研究內容

1、CSF ctDNA甲基化區域特征及其在染色體上的分布

為了確定GBM患者腦脊液（CSF）中ctDNA甲基化區域的分布和大小，作者通過ctDNA甲基化測序結果可視化分析，結果表明CSF ctDNA甲基化區域在染色體上的分布和峰值并無規律性。

 2、復發性GBM患者CSF ctDNA甲基化區域特征

為了從整體上分析**樣本與正常樣本之間ctDNA甲基化差異，作者通過研究CSF ctDNA甲基化區域的長度、標簽富集倍數分布和在基因組元件上的比例，發現G4組的富集峰長度( 354 ~ 98298 bp)及標準化標簽富集倍數均高于其他**樣本，其余大部分**樣本的甲基化富集倍數集中在2到3之間，復發性GBM甲基化區域在基因組元件上的分布無明顯差異。

3、 CSF ctDNA甲基化水平及差異基因篩選

為了篩選與復發性GBM預后和診斷相關的基因，作者分析了GSE132118的甲基化譜、CSF的ctDNA差異甲基化區域和**組織中mRNA差異基因。對**組( G1 ~ G4 )和正常組( NC )腦脊液樣本的甲基化區域進行鑒定，發現由于**樣本之間的特異性，G4的甲基化水平高于其他**樣本，G1在所有**樣本中的甲基化水平**。作者對**組織樣本的mRNA表達譜進行分析，發現共有2123個基因在**組和正常組之間存在差異（p＜0.05）。GSE132118由111個膠質瘤cf DNA樣本和111個配對的正常cf DNA樣本組成，在分析中篩選出9199個差異甲基化基因。對三組數據(腦脊液ct DNA差異甲基化區域、**組織mRNA差異基因、GSE132118)合并分析，篩選出530個共有基因。通過對530個基因進行 GO和 KEGG分析，結果表明BP排名前5位的條目分別為離子跨膜轉運調控、化學突觸傳遞調節，以及跨突觸信號傳導調節，陽離子跨膜轉運的認知與調控；KEGG前5位通路為GABA能突觸、谷氨酸能突觸和5-羥色胺能突觸、逆行內源性**素信號傳導和**成癮。 

4、 從530個基因中篩選hub基因

為了從530個基因中篩選出與復發性GBM預后和診斷相關的hub基因，作者從CGGA數據庫中收集109例復發GBM和20例正常腦組織的轉錄組數據和臨床信息作為訓練隊列并納入之后分析?；趩巫兞縞ox回歸模型，共發現68個hub基因與總生存期**相關。采用多因素cox分析法篩選出20個基因，再*終篩選出8個基因（FLRT2、ETV1、NKD1、GNB5、NTRK3、COMMD1、C1orf226和CHI3L2）構建預后模型。

5、 構建基于8個hub基因的預后模型

作者根據CGGA數據集中8個hub基因的表達情況計算每個樣本中基因的風險評分，并根據風險評分的中位數將樣本分為高風險和低風險組，結果表明高危組患者的OS**低于低危組患者( p < 0.001) ，并且隨著生存時間的增加，患者的風險評分和死亡率也隨之增加，這意味著hub基因表達水平較高的患者一般預后更差。hub基因表達熱圖顯示FLRT2、ETV1、NTRK3、C1orf226與風險評分成正比，NKD1、GNB5、COMMD1、CHI3L2與風險評分成反比。為了評估hub基因的預后能力，作者采用ROC曲線( 3年)計算風險評分和其他臨床信息，包括性別、年齡、IDH突變狀態、1p19q缺失狀態、MGMTp甲基化狀態的AUC，發現與其他臨床信息( AUC = 0.876)相比，這些基因在預測OS方面具有更高的敏感性和特異性。此外，風險評分被用作預測患者結果的**預后因素( p < 0.001)。作者基于這些hub基因在復發性GBM中的表達水平建立了臨床預后模型，可作為評估患者臨床風險的**后參數。

6、 基于8個hub基因構建診斷模型

作者基于GSE132118樣本中111例膠質瘤和111例正常血漿cfDNA的甲基化水平，對上述8個hub基因進行二元logistic回歸分析。利用這些基因的診斷預測因子計算8個基因的聯合診斷ROC ，結果表明，COMMD1 ( AUC = 0.801)、C1orf226( AUC = 0.781)和CH3L2( AUC = 0.850)的AUC值相對較高；FLRT2 ( AUC = 0.598)、ETV1 ( AUC = 0.580)、NKD1 ( AUC = 0.446)、GNB5 ( AUC = 0.680)、NTRK3 ( AUC = 0.597)的AUC值較低。hub基因( AUC = 0.944)的聯合診斷ROC（AUC=0.944）大于單個基因，表明基于8個hub基因構建的診斷模型較預測復發性膠質母細胞瘤的發生方面具有較高的準確性。

云序生物ctDNA甲基化測序服務

云序生物率先推出ctDNA甲基化測序服務?？蛻?需提供血漿，血清或體液樣本，云序生物為您完成從ctDNA提取，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。

云序生物針對ctDNA甲基化測序可以提供 MeDIP-seq以及EM-seq兩種技術。

技術1 ctDNA甲基化測序（免疫共沉淀測序）：通過5mC抗體特異性抓取基因組上發生甲基化的ctDNA片段，并結合高通量測序技術，高性價比檢測ctDNA甲基區域。

ctDNA甲基化優勢：

1.1 相比傳統WGBS全基因組檢測，性價比更高！

1.2 實現對甲基化（5mC）和羥甲基化（5hmC）的區分。

技術2  EM-seq（單堿基測序）：該方法結合使用多種酶，在保證 5mC 和 5hmC 在 Illumina 測序中仍被識別為 C 的前提條件下，將未發生修飾的胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U），并在后續的擴增和測序過程中被識別為胸腺嘧啶（T）。

EM-seq優勢（相比傳統WGBS）

2.1 DNA測序文庫質量高、所需 DNA 起始量小，可低至10ng DNA。

2.2 DNA文庫的插入片段更長、更完整

2.3 出色的GC覆蓋均一性

2.4 均一的雙核苷酸分布

2.5 更強的匹配率和更低的重復率

2.6 用更少的測序檢出更多的 CpG 島

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