云序用戶通過circle-seq在家蠶中發現具有重要功能的 eccDNA

染色體外環狀 DNA（Extrachromosomal DNA，簡稱 eccDNA） 已在許多物種當中發現，但此前在家蠶（Bombyx mori）等昆蟲當中缺乏報道。家蠶絲腺細胞在幼蟲發育階段，雖然存在 DNA 復制，但卻缺乏細胞分裂，形成遺傳學上非常經典的多線染色體（Polytene chromosome）結構。那么，在家蠶幼蟲絲腺特殊的發育階段當中，eccDNA 是否在其中扮演一定的角色呢？云序客戶蘇州大學胡小龍、貢成良教授團隊在昆蟲學專業期刊 Insect Science 上發表論文，揭曉了這一答案。作者與云序生物合作，對家蠶的絲腺組織來源的 eccDNA進行了測序研究。在此基礎上，該研究還**進行了單種 eccDNA 的體外合成以及體內轉染，并證明了eccDNA^fib-L 的濃度與 fib-L 的 RNA 水平乃至于蛋白質表達水平之間的正相關關系，為 eccDNA 的功能研究提供了一種全新的方法思路。

論文標題：Identification and characterization of extrachromosomal circular DNA in the silk gland of Bombyx mori
發表日期：2023年2月24日
發表期刊：Inesct Science
研究方法：eccDNAcircle-seq、eccDNA  Sanger 測序 等

1、家蠶絲腺 eccDNA 的特征
作者進行了家蠶絲腺組織來源 eccDNA 的測序（circle-seq），共計檢測到了 35346 種 eccDNA。它們的大小從 30 bp 到 13569549 bp 不等，但絕大多數 eccDNA （占比 94.25%）都集中分布在 50 bp 到 1000 bp 的范圍之內。eccDNA **來源于每一條染色體，惟第 11 號染色體的 eccDNA 數目*多，而第 2 號染色體產生的 eccDNA 數目*少。若考量 eccDNA 的來源密度，第 11 號染色體上的密度**，高達 88.9 eccDNA/Mb，而第 24 號染色體上的密度**，*為 63.9 eccDNA/Mb。在第 22 號染色體上發現了 3 處 eccDNA 來源熱點區域（hot spots），而在第 3 號染色體上則未發現任何 eccDNA 來源熱點區域。根據 eccDNA 的來源區域不同，它們被分為了基因間區（intergentic）、外顯子（exonic）、內含子（intronic）、外顯子加內含子（intron-exon）四大類別，其中基因間區來源的 eccDNA *多（占 58.6%），外顯子來源 eccDNA 占比其次（38.2%），而內含子（2.9%）和外顯子加內含子（0.3%）來源類型的 eccDNA 則較少。

2、eccDNA 成環位點周邊序列具有保守性
作者通過測序數據分析了該項目中全體 eccDNA 成環位點的上下游 10 bp 序列的基序（motif）特征。eccDNA 起始位點上游 10 bp 的序列被定義為 Sequence I，eccDNA 起始位點下游 10 bp 的序列被定義為 Sequence II，eccDNA 終止位點上游 10 bp 的序列被定義為 Sequence III，eccDNA 終止位點下游 10 bp 的序列被定義為 Sequence IV。Motif 分析結果表明，各類基因區域來源類型的 eccDNA (包括基因間的、外顯子的、內含子的和內含子加外顯子來源的 eccDNA)當中，eccDNA 5′ 起始位點和3′ 終止位點兩側的序列具有相似的特征：Sequence I 和 III 之間存在重復特征（記為“direct repeat 1”），Sequence II 和 IV 之間也存在重復特征（記為“direct repeat 2”）

3、個別 eccDNA 的驗證
作者從eccDNA測序結果當中隨機選取4 個eccDNA候選物(BMSK_chr2:1844506?1844923,BMSK_chr26:266530?266944,BMSK_chr28:294996?295352,BMSK_chr14: 9692083?9692623)進行驗證。針對理論成環位點的 Sanger 測序結果顯示，這 4 個 eccDNA 候選物的實際成環序列與理論序列完全一致，驗證了這些 eccDNA 的真實性。

4、eccDNA 上的攜帶基因
作者認為 eccDNA所攜帶的基因決定了它們的生物作用，因此使用GO 和 KEGG 對這些基因進行了通路和功能富集分析。*主要的的GO條目集中于對刺激的反應（response to stimulus）、細胞膜（membrane）和多種結合（binding）等類型，還有一些由eccDNAs攜帶的基因與多細胞有機體過程（multicellular organismal process）、內膜系統（endomembrane system）和有機環化合物結合（organic cyclic compound binding）有關。KEGG 分析結果則顯示，eccDNA 來源基因富集于 cAMP 信號通路（cAMP signaling pathway）、愛帕琳肽信號通路（Apelin signaling pathway）、胰島素信號通路（Insulin signaling pathway）、腎上腺素信號通路（Adrenergic signaling pathway）、胰***素信號通路（Glucagon signaling pathway）、*****釋放**信號通路（Gonadotropin-releasing hormone signaling pathway）、醛固酮合成和分泌信號通路（Aldosterone synthesis and secretion signaling）、GABA 能突觸信號通路（(GABA)ergic synapse）以及過氧化物酶增殖體**受體信號通路（Peroxisome proliferator-activated receptor signaling pathway）。

 并且，eccDNA 上攜帶有蠶絲蛋白相關的基因。例如：來自BMSK_chr25: 560150?11093027 的 eccDNA 上攜帶了 fib-H 完整基因（BMSK_chr25: 10496502?10511948）。此外，還存在多達 20 個 eccDNA 攜帶了 fib-L 基因（BMSK_chr14: 9687749?9700916）的一部分，其大小分布在 92 bp 到 1101 bp 之間，但并無任何 eccDNA 含有 fib-L 完整基因。此外，還有大量其它 eccDNA 上含有一部分蠶絲蛋白相關的基因。

5、對eccDNA^fib-L的功能評估
作者選取了來自 chr14 上 9692083 位到 9692623 位的 eccDNA（后續記為 eccDNAfib-L）進行后續的實驗。該 eccDNA 上攜帶有一部分 fib-L 基因的序列。通過針對成環位點的引物設計，作者進行了 RCA 滾環擴增，驗證了這個 eccDNA^fib-L的真實存在——滾環擴增產物的大小片段與理論長度的倍數相符。作者還對 eccDNA^fib-L 行了熒光原位雜交（FISH），在五齡幼蟲的絲腺當中檢測到了熒光信號。綜上所述，蠶的絲腺細胞具有產生eccDNA^fib-L的能力。

為了驗證 eccDNA^fib-L 的生物學功能，作者使用 5’ 磷酸化引物以及 T4 連接酶在體外合成了不同劑量的eccDNA^fib-L，并將它們轉染到家蠶培養細胞當中，通過 qPCR 檢測 fib-L 的 mRNA 水平。結果顯示，fib-L 的 mRNA 水平與 eccDNA^fib-L 轉染劑量之間存在正相關的關系。作者隨后還進行了體內實驗，將 2 μg 體外合成的 eccDNA^fib-L 注射到五齡幼蟲的體腔（body cavity）內，并與注射了 PBS 的對照組五齡幼蟲進行比較。在 eccDNA 水平上，注射組的 eccDNAfib-L 水平要高于對照組；在 fib-L 的 mRNA 水平上，無論是注射后 24、48、72 小時，都是注射組高于對照組；在 Fil-L 蛋白水平上，Western blot 實驗也顯示，無論是注射后 24、48、72 小時，都是注射組高于對照組。綜上所述，eccDNA^fib-L可以促進 fib-L 在 RNA 水平和蛋白質水平的表達。

本文介紹了家蠶絲腺細胞中染色體外環狀 DNA（eccDNA）的研究。通過測序分析，發現eccDNA在家蠶絲腺中存在，而且**來源于每一條染色體。eccDNA上攜帶有多種基因，包括與蠶絲蛋白相關的基因。作者針對其中一個eccDNA^fib-L進行了功能評估，通過體外合成和體內轉染實驗，證明eccDNA^fib-L可以促進蠶絲蛋白基因fib-L在RNA和蛋白質水平的表達。這項研究為eccDNA的功能研究提供了一種全新的方法思路，也為理解家蠶絲腺細胞發育和基因調控提供了新的認識。

云序生物是國內率先提供環狀DNA測序服務的公司，早在2018年已啟動了環狀DNA測序技術的開發。2019年，云序發布了組織細胞環狀 DNA 測序（circle-seq），并成為A&A Bio**代理（該品牌的環狀 DNA 純化柱被絕大部分環狀DNA高分文章采用）。2020年，云序又相繼發布了體液樣品環狀DNA測序及體液樣品環狀DNA甲基化測序服務，擁有豐富的環狀DNA測序產品線。云序生物環狀DNA測序采用雙端測序，上機測序數據量24G。迄今為止，我們已經完成上千例樣品的環狀DNA測序，積累了豐富的項目經驗，樣品類型涵蓋：組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等，物種涵蓋：人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。2021年，云序生物的客戶發表國內首批 eccDNA 研究論文，其中更有發表于發表于 Nature Communications 上的高分研究 。

云序生物eccDNA相關產品

2.體液樣品環狀DNA測序
針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品，云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開eccDNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高，損耗低，實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量，使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。
技術優勢：
減少DNA損失
保留原始表達量，不同環狀DNA間表達量比較更準確

3.體液樣品環狀DNA甲基化測序
針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品，云序參考盧煜明教授團隊 2021 年研發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開環狀DNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，并用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U，進行建庫及測序。一次建庫測序中同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化位點的信息。

技術優勢：
一箭雙雕：同時檢測環狀DNA及其甲基化狀況，節約樣品，性價比高
單堿基分辨的環狀DNA甲基化分析
4.環狀DNA sanger測序
針對測序項目中篩選出的環狀DNA，云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。其主要目的在于：為用戶提供一種低成本的擴大樣品量驗證手段，節約實驗成本。通過設計反向引物進行PCR擴增，將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序，驗證連接位點處序列。
5.A&A Biotechnology 環狀 DNA 純化柱
A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分環狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內的**總代理。

優勢一：國內率先提供環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序的公司，同時也是**有客戶發表 10 分以上 eccDNA 論文的公司。
優勢二：擁有包括組織細胞/體液樣品環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序在內豐富的環狀DNA測序產品線。
優勢三：A&A Biotechnology 總代理，采用原裝A&A Bio純化柱，環狀DNA 純化效果好。
優勢四：一站式服務：您只需按照送樣要求向云序生物寄送樣品，我們就能為您完成從環狀DNA 提取，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。 
優勢五：嚴格質控流程：云序生物質控流程嚴格，層層把關，為客戶提供高準確度的結果。
優勢六：專業化生物信息分析：云序生物強大生物信息團隊，滿足客戶個性化數據分析要求。

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