云序用戶農口IF20+論文：植物mRNA存在ac4C新型修飾，對RNA穩定性及翻譯產生重要影響

N4-乙酰胞嘧啶（ac4C）是一種高度保守的RNA修飾，**存在于細菌、酵母和人類的tRNA和rRNA中。近年的一些研究表明，ac4C修飾同樣存在于mRNA上，是一種新型的mRNA修飾。即使是在嗜熱古菌（Hyperthermophilic archaea）和***毒（HIV-1）這樣的特殊物種當中也都發現了ac4C修飾，起到調控嗜熱古菌對極端高溫環境的適應以及調控***毒復制的作用。然而，在植物當中，ac4C修飾是否存在于mRNA上仍存在爭議。云序生物客戶湖南大學何崇圣課題組通過LC-MS 、 acRIP-seq 以及翻譯組學研究實驗等手段，證明了在雙子葉植物**物種擬南芥（Arabidopsis thaliana）和單子葉植物**物種水稻（Oryza sativa）當中 mRNA 上 ac4C 乙?；揎椀钠毡榇嬖?，并探討了其在 RNA 穩定性、RNA 可變剪接、蛋白翻譯以及 RNA 空間結構方面的調控作用。云序生物有幸參與了其中LC-MS 以及 acRIP-seq 實驗。

論文標題：Transcriptome-wide profiling of RNA N4-cytidine acetylation in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa
發表日期：2023年04月12日
發表期刊：Molecular Plant
影響因子：21.949
研究方法：LC-MS/MS檢測核酸修飾水平、acRIP-seq 等

2、選用 acRIP-seq 技術進行后續研究
為了高通量地研究 RNA 上的 ac4C 乙?；揎?，存在多種不同的實驗方法，包括使用 ac4C 抗體富集的 acRIP-seq方法（Acetylated RNA Immunoprecipitation Sequencing），以及使用化學試劑處理引發 ac4C 到 T突變的 ac4C-seq。為了驗證兩種方法的效果，作者設計了一段帶有單個 ac4C 修飾位點的體外轉錄本（in vitro transcript，記作“IVT”），將其摻入植物樣品來源的 RNA 中當作外參。當 IVT 與植物總 RNA 比例為 1：1 時，acRIP-seq 和 ac4C-seq 兩種測序方法都可以有效檢出 IVT 上的 ac4C 修飾。然而，當 IVT 與植物總 RNA 比例為 1：5000 時，ac4C-seq 無法檢出 IVT 當中的 ac4C 修飾，只有  acRIP-seq 在 1：5000 的低濃度時仍然能檢測到 IVT 上的 ac4C 修飾?？紤]到生物體內 ac4C 的發生比例較低，需要靈敏檢出低豐度的 ac4C 修飾，因此作者后續與云序生物合作，采用了 acRIP-seq 作為 RNA 樣品乙?；揎椄咄繙y序的方法。

3、擬南芥和水稻的 ac4C 乙?；V
通過 acRIP-seq，作者在外源的 IVT 以及內源的 rRNA 上都檢測到了理論預測要出現的 ac4C 峰，證明該實驗方法的可靠性。acRIP-seq 結果顯示，ac4C 修飾**分布在擬南芥和水稻的整個基因組的各個染色體上。

無論是擬南芥還是水稻，其 ac4C 乙?；宥技蟹植加谄鹗济艽a子附近，亦在整個 CDS 區具有較高豐度。該現象與早前在哺乳動物當中報道過的 ac4C 修飾分布情況類似，暗示可能存在進化上的保守性。無論是擬南芥還是水稻，單個轉錄本上的 ac4C 峰個數都存在遞減現象。

4、擬南芥和水稻 ac4C 修飾基因的比較
為了研究植物中RNA ac4C修飾的進化保守性和潛在功能，作者比較了擬南芥和水稻中ac 4C的修飾基因。GO 分析顯示，擬南芥和水稻當中的 ac4C 修飾基因具有一定的相似性，重復出現的 GO 條目包括核糖體生物發生（ribosome biogenesis）、光合作用（photosynthesis）、糖酵解（glycolytic process）以及對植物**的反應（response to phytohormone）等。擬南芥的 ac4C 修飾基因特有富集的 GO 條目與RNA結合（RNA binding）以及應激反應（stress response）有關，而水稻 ac4C 修飾基因特有富集的 GO 條目則與翻譯（translation）活動相關。在擬南芥的 2160 個 ac4C 乙?；虍斨?，有 1574 個在水稻當中存在同源基因；而在水稻的 3824 個 ac4C 乙?；虍斨?，有 2619 個在擬南芥中存在同源基因。有多達 634 個 ac4C 乙?；蛟跀M南芥和水稻當中同時被檢測到，其中有一個編碼超氧化物歧化酶的基因，在擬南芥當中未 AtSOD2，在水稻當中的同源基因為 OsSOD4，它們的起始密碼子附近都有檢測到一個非常明顯的 ac4C 乙?；?。此外，也存在一些物種特異性的 ac4C 乙?；?，例如擬南芥當中的 PIN3 基因和水稻中的 OsIAA21 基因。

根據以往的報道，在哺乳動物當中，RNA 的 ac4C 乙?；揎椏赡艽嬖诠餐幕颍╩otif）特征。為了探明在植物當中是否也存在 ac4C 特征 motif， 作者對擬南芥和水稻進行了 ac4C motif 分析，結果發現：在擬南芥當中，HYCHYCWYCWYC 和 CUUCUUCYUCYU 是*常見的 RNA ac4C 乙?；?motif；而在水稻當中，CBHCAAGNHC、SVAGHHSUAC 和 CNNCNNCNNC 是*常見的 RNA ac4C 乙?；?motif。在擬南芥和水稻兩個物種之間，則存在 CCAA 這樣一個共有的 RNA ac4C 乙?；?motif。然而，在 UTR 區域，幾乎找不到共有的 motif 特征。綜上所述，作者認為植物的 RNA ac4C 乙?；揎椉创嬖诳缥锓N保守性，也存在一定的物種特異性。

根據以往的報道，在人類當中，RNA 的 ac4C 乙?；揎検?NAT10 酶的催化。為了探明植物當中 NAT10 的同源物，作者使用人類 NAT10 蛋白全長通過 BLAST 尋找其在擬南芥和水稻當中的同源蛋白。通過一系列后續實驗，作者證明了AtNAT10a 和 AtNAT10b 是擬南芥的 NAT10 同源蛋白，且這兩個基因的敲除在擬南芥中是致死的；而在水稻當中，NAT10 的同源蛋白是osNAT10，它調控水稻幼苗的發育，影響水稻穗（panicles）的數量，并*終影響到產量的提高。

5、植物 RNA ac4C 修飾的功能：增強 RNA 穩定性和調控可變剪接
根據以往已發表的文獻，作者發現 ac4C 修飾的 mRNA 擁有更長的半衰期。為了驗證這一結論是否在植物當中成立，作者在擬南芥和水稻當中使用轉錄抑制劑放線菌素D（actinomycin D）以抑制新 mRNA 的生成，并在此基礎上檢測原有 mRNA 的留存水平。在水稻當中，5 個 ac4C 修飾的基因 (Os05g0103400, Os02g0509500, OsSOD4, OsTMK 和 OsIAA21) 在野生型（WT）當中都比乙?；揎椧种菩停╫snat10-1）表現出更高的 mRNA 穩定性。在擬南芥當中，ac4C(+) 基因（AT1G09310 和 AT2G28190）亦表現出比 ac4C(-)基因（At1G69960 ，即 PP2A）更高的穩定性。為排除放線菌素D對 RNA 乙?；揎椀挠绊?，作者還進行了 ac4C dot blot 實驗，在放線菌素D處理組和 mock 組之間觀測到近似的 ac4C 修飾水平。綜上所述，作者認為 RNA 的ac4C 修飾提升了 mRNA 的穩定性。除此之外，作者亦通過其它一系列實驗證明了 RNA 的 ac4C 乙?；揎棿龠M了 RNA 的可變剪接，提供了更加豐富的可變剪接轉錄本類型。

6、植物 RNA ac4C 修飾的功能：促進翻譯和抑制空間結構
RNA 修飾除了可能影響轉錄本的穩定性和可變剪接以外，還可能影響到蛋白質的翻譯效率。作者通過 RNC-mRNA-seq 實驗發現，ac4C(+) 基因的翻譯效率要**高于 ac4C(-) 基因，且 UTR 區域發生 ac4C 修飾的基因的翻譯效率要**高于 CDS 區域發生 ac4C 修飾的基因。如果進一步細分 CDS 區域，將前 10% 定義為 “near 5’UTR”，將中間的 10% 定義為 “middle”，將后 10% 定義為 “near 3’UTR”，則“near 5’UTR”和“near 3’UTR”上發生 ac4C 修飾基因的翻譯效率要**高于“middle”類型。綜上所述，作者認為 UTR 區域以及 CDS 上接近 UTR 的區域上的 ac4C 乙?；揎棇⑵鸬教嵘g效率的作用。在野生型與乙?；揎椧种菩停╫snat10-1）之間比較可以發現，ac4C(+) 基因在野生型當中的翻譯效率要高于乙?；揎椧种菩?。作者挑選了兩個擬南芥的 ac4C 修飾基因（HIRD11 和 AT2G15960）和兩個水稻的 ac4C 修飾基因（Os05g0103400 和 Os02g0509500），發現其 ac4C(+) 修飾型轉錄本比 ac4C(-) 未修飾型轉錄本的蛋白表達量都要高，且在水稻當中的提升倍數比擬南芥中更大，暗示水稻中的 RNA ac4C 修飾與翻譯效率之間的關聯比在擬南芥中更強。除此之外，作者亦通過其它一系列實驗證明了 RNA 的 ac4C 乙?；揎椗c RNA 的空間結構之間存在負相關的關系，即 ac4C 乙?；揎椀?RNA 更傾向于擁有簡單的單鏈結構。

作者通過 LC-MS 以及 acRIP-seq 等技術，在雙子葉植物**物種擬南芥（Arabidopsis thaliana）和單子葉植物**物種水稻（Oryza sativa）當中的 mRNA 上 ac4C 乙?；揎椀钠毡榇嬖?，并揭示了其乙?；揎椬V的基本特征。本項研究發現，在擬南芥和水稻當中，RNA 的 ac4C 乙?；揎椏商岣?mRNA 穩定性，促進 RNA 可變剪接，提升蛋白翻譯效率，并減少 RNA 出現空間結構。該論文拓展了 RNA ac4C 乙?；揎椀奈锓N研究范圍，揭示了 RNA ac4C 乙?；揎椩陔p子葉植物和單子葉植物當中的普遍存在及其生物學功能。 

01 ac4C RNA修飾測序
ac4C RNA修飾測序
對ac4C RNA乙?；?，目前***的檢測手段為acRIP-seq技術，適用于ac4C RNA乙?；V研究，快速篩選ac4C RNA乙?；谢?。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的ac4C測序：

• ac4C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

• ac4C  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

• ac4C  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

• ac4C  mRNA測序

• ac4C  rRNA測序

• ac4C  circRNA測序

• ac4C  tRNA測序

02 檢測整體ac4C RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
03 ac4C RNA修飾上游酶的篩選
ac4C RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控ac4C RNA乙?；募谆D移酶。
04 ac4C RNA修飾靶基因驗證
acRIP-qPCR
云序提供acRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證靶基因RNA修飾水平。
05 機制互作研究
RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
06 翻譯組
Ribo-seq（核糖體印記測序）
捕獲核糖體保護的 mRNA 片段，助力探索蛋白質合成的基因表達調控機制。

優勢一：云序累計支持客戶發表百余篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子1000+, 其中RNA乙?；瘻y序有多達4篇影響因子接近20 分的高分論文。
優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：提供ac4C一站式服務：ac4C整體水平檢測、acRIP-seq、acRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull down等。
優勢五：率先研發超微量acRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內較全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。

相關產品

LC-MS檢測整體ac4C甲基化水平

ac4C RNA乙?；瘻y序

m5C RNA甲基化測序

m1A RNA甲基化測序

  m7G RNA甲基化測序

O8G RNA氧化修飾測序

2’-O-RNA甲基化測序

m6Am RNA甲基化測序

RNA修飾相關酶PCR芯片