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用戶文章IF=19.568|m5C修飾測序助力NSUN2調控病毒I型干擾素反應的機制研究
云序生物有幸參與了此項研究中的m5C MeRIP-seq、m5C Bis-seq、RNA-seq等多項高通量測序技術服務。值得一提的是針對m5C RNA甲基化測序，本文同時應用了云序生物提供的m5C MeRIP-seq和m5C Bis-seq兩種測序方法，通過不同技術手段幫研究者實現研究目的。
m5C是一種**存在的轉錄后RNA修飾，通過調節RNA代謝參與多種細胞反應和生物過程。然而，其在抗病毒先天免疫中的調節作用尚未闡明。2023年2月4日，云序客戶武漢大學陳宇課題組在Emerg Microbes Infect雜志（IF=19.568）上發表了“NSUN2-mediated M5 c methylation of IRF3 mRNA negatively regulates type I interferon responses during various viral infections”。該研究發現，m5 C甲基轉移酶NSUN2，在包括****SARS-CoV-2在內的各種病毒**過程中負調控I型干擾素反應，內源性NSUN2水平在SARS-CoV-2和各種病毒**期間下降，以促進抗病毒應答，從而有效消除病毒。云序生物有幸參與了此項研究中的m5C MeRIP-seq、m5C Bis-seq、RNA-seq等多項高通量測序技術服務。值得一提的是針對m5C RNA甲基化測序，本文同時應用了云序生物提供的m5C MeRIP-seq和m5C Bis-seq兩種測序方法，通過不同技術手段幫研究者實現研究目的。
發表期刊：Emerg Microbes Infect
影響因子：19.568
發表時間：2023年2月4日
研究方法：m5C MeRIP-seq、m5C Bis-seq、RNA-seq、LC-MS/MS
文章鏈接：NSUN2-mediated M5c methylation of IRF3 mRNA negatively regulates type I interferon responses during various viral infections
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1、NSUN2負調控I型干擾素反應
為了探索參與I型干擾素反應的RNA甲基轉移酶或去甲基化酶的功能，文章使用小干擾RNA（siRNAs）敲除HEK293T細胞中不同的RNA甲基轉移酶或去甲基化酶，并檢測內源性IFNB1 mRNA水平。qPCR結果發現，NSUN2的敲除可以更**地提高內源性IFNB1 mRNA水平（圖1a）。為了證實NSUN2對I型干擾素反應的影響，文章檢測了外源性NSUN2的表達，發現它可以以劑量依賴性的方式抑制仙臺病毒（SeV）誘導的IFN-β啟動子活性的**（圖1b）。外源性NSUN2的表達也可以抑制不同刺激物誘導的IFN-β啟動子活性的**（圖1c）。在NSUN2敲低的HEK293T細胞中，SeV誘導的內源性IFNB1 mRNA水平的增加**增加，下游的ISG15和CXCL10的mRNA水平也**增加（圖1d）。SeV誘導的I型干擾素反應在NSUN2敲除的HEK293T細胞中也**增強(圖1e)。此外，NSUN2的敲除也促進了SeV誘導的I型干擾素對HeLa、THP-1、骨髓來源樹突狀細胞（BMDCs）和骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）的I型干擾素反應（圖1f，g）。在SARS-CoV-2**的Caco-2細胞中，敲除NSUN2持續促進了I型干擾素應答，這表明NSUN2在SARS-CoV-2**中也發揮了重要的調控作用（圖1h）。
接下來，文章繼續研究了NSUN2是否參與了水皰性口炎病毒（VSV）**期間的抗病毒應答。在HEK293T中敲除NSUN2**抑制了攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報告基因（VSV-GFP）的VSV的復制（圖1i），魯索利替尼可以增強VSV對NSUN2敲除細胞中增殖的抑制作用（圖1j）。此外，敲除NSUN2抑制了SeV、VSV和單純皰疹病毒1（HSV-1）在A549野生型細胞中的增殖，但在A549IFNAR1?/?細胞中沒有增殖（圖1k）。為了進一步研究NSUN2在病毒**過程中的生物學作用，文章觀察到在SeV或寨卡病毒（ZIKV）**后，NSUN2 mRNA隨著時間的推移而減少，這揭示了NSUN2在病毒**過程中的潛在功能（圖1m）。值得注意的是，文章發現SARS-CoV-2**也可以**降低Caco-2細胞中的NSUN2 mRNA水平（圖1n）。因此，文章進一步對從2例covid-19患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中分離的RNA進行了RNA-seq。結果發現與健康人相比，COVID-19患者的NSUN2 mRNA水平持續降低（圖1o)。綜上所述，NSUN2可能作為I型干擾素應答的負調控因子，在包括SARSCoV-2在內的不同病毒**期間，NSUN2的表達**降低，以增強抗病毒I型干擾素應答。
2、NSUN2通過調節IRF3的表達水平來抑制I型干擾素反應
文章發現外源性NSUN2的表達**抑制了上游**物誘導的PRDIIII-luc活性（圖2a），而抑制NSUN2有相反的效果（圖2b）。由于IRF3是I型干擾素應答啟動過程中的*終因素，文章推測NSUN2可能在IRF3節點上發揮其功能。免疫印跡分析顯示，外源性NSUN2表達可以抑制內源性IRF3水平增強（2c），相比之下，內源性TBK1蛋白水平沒有明顯變化。此外，敲除NSUN2促進了IRF3 Ser396的磷酸化水平，對TBK1 Ser172的磷酸化水平則無促進效果（圖2e，f）。這些結果表明，NSUN2的缺失可以提高IRF3蛋白的整體水平及其磷酸化水平。qPCR分析結果顯示IRF3是NSUN2調控干擾素反應的主要下游靶點（圖2g）。因此，文章進一步使用IRF3?/?Irf7?/?mef，將NSUN2和IRF3-FL與VSV或HSV-1**共轉染，發現NSUN2對病毒繁殖的促進依賴于IRF3的存在（圖2h）。綜上所述，這些結果表明，NSUN2可以特異性抑制IRF3的表達，從而負調控病毒**后的I型干擾素應答。
3、NSUN2催化IRF3 mRNA的m5 C甲基化
文章推測NSUN2可能與IRF3 mRNA發生物理上的相互作用。CO-IP和WB結果顯示，在HEK293T中，NSUN2和IRF3蛋白之間沒有相互作用（圖3a）。文章進一步在SeV刺激的HEK293T細胞中過表達并免疫沉淀NSUN2蛋白，并對其進行RNA提取和qPCR。結果顯示，NSUN2確實與內源性IRF3 mRNA結合，而內源性TBK1 mRNA不與NSUN2相互作用（圖3b），敲除NSUN2提高了內源性IRF3 mRNA水平，而內源性TBK1 mRNA水平沒有受到影響(圖3c，d）。隨后，文章檢測了野生型和NSUN2mRNA2?/?HEK293T細胞內源性IRF3 mRNA的半衰期，結果發現，敲除NSUN2**提高了IRF3 mRNA的半衰期（圖3e）。此外，文章使用HA-tag抗體從NSUN2-/- HEK293T中沉淀HA-NSUN2蛋白，并重組外源性HANSUN2（圖3f）。綜上結果表明，NSUN2主要通過與IRF3 mRNA結合并加速其降解來降低IRF3蛋白水平。
使用重組GST-NSUN2和3h標記的S-腺苷蛋氨酸（SAM）對這些RNA進行體外甲基化分析。與RIG-I、MAVS和TBK1的轉錄本相比，轉錄后的IRF3 mRNA可被NSUN2高度甲基化（圖4a，b）。這些數據表明，與RIG-I、MAVS和TBK1 mRNA相比，NSUN2可以在體外有效地介導IRF3 mRNA的甲基化。為了確定哪個區域可能被甲基化，文章將IRF3 mRNA分為7個部分（圖4a），與其他片段相比，IRF3 5‘UTR、3’UTR、CDS2和CDS3被NSUN2高度甲基化（圖4c）。將等量的內源性IRF3 mRNA裝載在細胞膜上，并測定m5 C的水平。m5C merip-seq結果顯示，NSUN2敲除細胞中IRF3 mRNA的m5 C甲基化水平明顯低于野生型細胞（圖4d）。m5C meRIP-qPCR的結果顯示，NSUN2敲除細胞中內源性m5 C甲基化的IRF3 mRNA水平明顯低于野生型細胞，而外源性NSUN2的表達可**提高內源性m5 C-甲基化的IRF3 mRNA水平（圖4e）。隨后，文章進一步通過RNA-seq數據分析了過表達NSUN2的HEK293T細胞或HEK293T細胞中mRNA的表達水平。從這些結果來看，在NSUN2過表達的細胞中，IRF3、IFNB1及其下游的ISGs持續下調（圖4f），而相應的SeV復制增強（圖4g）。然而，上游信號因子如RIG-I（DDX58）、TBK1或MAVS并沒有表現出NSUN2的一致或**調控。這些結果顯示，NSUN2介導的IRF3 mRNA的m5 C甲基化調控了IRF3 mRNA水平和IRF3介導的IFNB1和下游ISGs水平（圖4d,e）。甲基轉移酶突變體C271A能提高NSUN2的催化活性（圖4h）。文章利用LC-MS/MS檢測了轉染了NSUN2或其突變體的NSUN2?/?HEK293T細胞中總RNA（圖4i）或mRNA（圖4j）的m5 C甲基化水平。如圖4(k)所示，與野生型NSUN2相比，I302A或C321A過表達后，SeV誘導-IFN-β熒光素酶檢測中部分抑制能力喪失，而C271A與野生型NSUN2相比可增強抑制能力。此外，在NSUN2?/?HEK293T細胞中，雙突變體I302A/C321A在功能（圖4l）和對IFNB1 mRNA水平的影響（圖4m）方面都完全失去了其抑制能力。
RNA-seq的GO分析結果表明敲除NSUN2有助于免疫應答的**升高，這進一步證明了NSUN2在抗病毒先天免疫應答中的關鍵作用（圖5a）。在A549 NSUN2敲除細胞中，IRF3、IFNB1及其下游ISGs持續上調，而相應的SeV復制受到抑制（圖5b，c）。同時，A549 NSUN2敲除細胞中內源性m5 C甲基化IRF3 mRNA水平**低于A549野生型細胞（圖5d）。
4、IRF3 mRNA的甲基化胞嘧啶調節RNA水平
m5C MeRIP-seq轉錄組分析發現了未**或sars-cov-2**的Caco-2細胞中RNA的內源性m5C位點（圖6a）。m5C Bis-seq分析發現（圖6b），IRF3 mRNA中的一個甲基化胞嘧啶是甲基化的主要位點，在體外被重組NSUN2蛋白高度甲基化：5‘UTR中的C169（圖6c）。此外，還發現了另外三個高度甲基化的胞嘧啶：3‘UTR中的C1569，CDS2中的C556（486-735），CDS3中的C815（736-985），與在IRF3 mRNA中觀察到的四個高甲基化區域一致(圖4c ）。進一步研究NSUN2對IRF3 mRNA的m5 C甲基化的生物學功能，如圖6(d)所示，敲除NSUN2可以增加報告基因pGL3-IRF3-5‘UTR、pGL3-IRF3-CDS和pGL3- IRF3-3’UTR的熒光素酶活性。在5‘UTR中觀察到突變C169（C到G），在3‘UTR中觀察到突變C1569（C到G），CDS2（486-735）的C556（C到T，同義突變）和CDS3（736-985）的C815（C到A，同義突變），這四個突變位點在重組NSUN2中的甲基化水平降低了一半。隨后，文章構建了包含野生型IRF3全長（IRF3-fl，1-1595nt）或不同位點突變的IRF3- FLs的表達質粒。發現與野生型IRF3全長（IRF3-FL-WT）相比，這4個胞嘧啶的突變可以持續提高IRF3?/?Irf7?/?mef中IRF3 mRNA的表達水平(圖6f）。位于CDS1（C303）或CDS4（C1135）中的另外兩個胞嘧啶（圖6a）在m5C Bis-seq中未被檢測到，并且對其功能沒有影響（圖6f和g）。綜上所述，研究結果表明，m5C修改的損失可能導致IRF3 mRNA的穩定性和增強IFN-β生產，從而促進更強的抗病毒反應，而IRF3 mRNA高度甲基化胞嘧啶在Nsun2介導的抗病毒反應發揮關鍵作用。
5、NSUN2在體內誘導I型干擾素和抗病毒應答中的關鍵作用
Nsun2+/?小鼠中Nsun2的表達比野生型同窩小鼠減少了一半（圖7a，b），在**SeV后，Nsun2+/?小鼠的BMDCs中內源性IRF3mRNA水平和蛋白水平均比野生型同窩小鼠中增強（圖7a，b）。此外，如圖7(c)所示，與使用SeV、HSV-1或VSV的野生型小鼠相比，Nsun2+/?小鼠的BMDCs中Ifnb1 mRNA水平**提高了。IFN-β介導的下游Isg15和Cxcl10在Nsun2+/?小鼠的BMDCs中也**增強（圖7d）。因此，在Nsun2+/?小鼠的BMDCs中，SeV、HSV-1或VSV明顯受到抑制（圖7e）。來自Nsun2+/?小鼠或Nsun2+/+小鼠的BMDCs的RNA-seq結果表明，在Nsun2+/?小鼠的BMDCs中，Irf3、Ifnb1和下游ISGs持續升高（圖7f）。同時，Nsun2+/?小鼠相比于Nsun2+/+小鼠，BMDCs中內源性m5 C甲基化的Irf3 mRNA水平更低（圖7g）。然而，mRNA上Rig-i、Tbk1或Mavs沒有**的m5 C修飾信號。在Nsun2+/?小鼠的BMDCs中，內源性IRF3 mRNA的穩定性更高（圖7h）。隨后，文章研究了野生型小鼠和Nsun2+/?小鼠的先天抗病毒應答。結果發現，在mRNA水平上，相比于野生型小鼠，Nsun2+/?小鼠不同**中的IFN-β產量更高，VSV的病毒負荷更低（圖7i）。并且在ELISA腹腔注射VSV后，Nsun2+/?小鼠的血清中IFN-β和IFN-α的產生**升高（圖7j）。此外，文章還比較了腹腔注射VSV后的生存率。結果表明，野生型小鼠比Nsun2+/?小鼠更容易發生VSV觸發的死亡（圖7k）。
文章進一步研究了SARSCoV-2**的K18-hACE2基因敲入（KI）小鼠模型的先天免疫應答和NSUN2的表達水平。研究發現SARS-CoV-2 WT菌株（圖8a）或BA.1 omicron變異（圖8b）**了K18-hACE2 KI小鼠模型中的先天免疫反應。SARS-CoV-2 WT菌株或BA的內源性Nsun2 mRNA水平**降低。與未**組相比，有1個omicron變異**組（圖8a和b）。這些結果與SARS-CoV-2**的Caco-2細胞模型和COVID-19患者相一致，共同表明NSUN2在SARS-CoV-2**中起著重要的調控作用（圖1n和o）。
本研究通過m5C MeRIP-seq、RNA-seq、m5C Bis-seq等多種技術的聯合分析，發現在病毒**過程中，內源性NSUN2的表達水平降低，因此IRF3 mRNA的m5 C修飾水平降低，但穩定性增加。因此，IRF3的表達水平提高，允許更強的干擾素反應和有效的消除病毒。這種重要的宿主抗病毒策略來調節干擾素反應的進化表明，NSUN2介導的m5 C修飾具有重要的生理意義。
m5C RNA甲基化測序（m5C-seq）
對m5C RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m5C-Seq技術，適用于m5C RNA甲基化譜研究，快速篩選m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m5C測序：
m5C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
m5C LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
m5C Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
m5C mRNA測序
02 檢測整體m5C RNA甲基化水平
LC-MS/MS檢測整體RNA甲基化水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
03 m5CRNA甲基化上游酶的篩選
m5CRNA甲基化相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m5C RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m5C RNA甲基化靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05 機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：可檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：提供m5C一站式服務：m5C整體水平檢測、m5C-seq、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優勢五：超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：提供多種 RNA 修飾測序服務，包含m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
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慶祝云序用戶m1A、m6A、m5C RNA甲基化測序文章三連發
云序用戶植物文章6連發：植物當中各類RNA甲基化測序該怎么發 ?
影響因子：19.568
發表時間：2023年2月4日
研究方法：m5C MeRIP-seq、m5C Bis-seq、RNA-seq、LC-MS/MS
文章鏈接：NSUN2-mediated M5c methylation of IRF3 mRNA negatively regulates type I interferon responses during various viral infections
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研究內容
1、NSUN2負調控I型干擾素反應
為了探索參與I型干擾素反應的RNA甲基轉移酶或去甲基化酶的功能，文章使用小干擾RNA（siRNAs）敲除HEK293T細胞中不同的RNA甲基轉移酶或去甲基化酶，并檢測內源性IFNB1 mRNA水平。qPCR結果發現，NSUN2的敲除可以更**地提高內源性IFNB1 mRNA水平（圖1a）。為了證實NSUN2對I型干擾素反應的影響，文章檢測了外源性NSUN2的表達，發現它可以以劑量依賴性的方式抑制仙臺病毒（SeV）誘導的IFN-β啟動子活性的**（圖1b）。外源性NSUN2的表達也可以抑制不同刺激物誘導的IFN-β啟動子活性的**（圖1c）。在NSUN2敲低的HEK293T細胞中，SeV誘導的內源性IFNB1 mRNA水平的增加**增加，下游的ISG15和CXCL10的mRNA水平也**增加（圖1d）。SeV誘導的I型干擾素反應在NSUN2敲除的HEK293T細胞中也**增強(圖1e)。此外，NSUN2的敲除也促進了SeV誘導的I型干擾素對HeLa、THP-1、骨髓來源樹突狀細胞（BMDCs）和骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）的I型干擾素反應（圖1f，g）。在SARS-CoV-2**的Caco-2細胞中，敲除NSUN2持續促進了I型干擾素應答，這表明NSUN2在SARS-CoV-2**中也發揮了重要的調控作用（圖1h）。
接下來，文章繼續研究了NSUN2是否參與了水皰性口炎病毒（VSV）**期間的抗病毒應答。在HEK293T中敲除NSUN2**抑制了攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報告基因（VSV-GFP）的VSV的復制（圖1i），魯索利替尼可以增強VSV對NSUN2敲除細胞中增殖的抑制作用（圖1j）。此外，敲除NSUN2抑制了SeV、VSV和單純皰疹病毒1（HSV-1）在A549野生型細胞中的增殖，但在A549IFNAR1?/?細胞中沒有增殖（圖1k）。為了進一步研究NSUN2在病毒**過程中的生物學作用，文章觀察到在SeV或寨卡病毒（ZIKV）**后，NSUN2 mRNA隨著時間的推移而減少，這揭示了NSUN2在病毒**過程中的潛在功能（圖1m）。值得注意的是，文章發現SARS-CoV-2**也可以**降低Caco-2細胞中的NSUN2 mRNA水平（圖1n）。因此，文章進一步對從2例covid-19患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中分離的RNA進行了RNA-seq。結果發現與健康人相比，COVID-19患者的NSUN2 mRNA水平持續降低（圖1o)。綜上所述，NSUN2可能作為I型干擾素應答的負調控因子，在包括SARSCoV-2在內的不同病毒**期間，NSUN2的表達**降低，以增強抗病毒I型干擾素應答。
圖1 NSUN2負調控抗病毒先天I型干擾素應答
2、NSUN2通過調節IRF3的表達水平來抑制I型干擾素反應
文章發現外源性NSUN2的表達**抑制了上游**物誘導的PRDIIII-luc活性（圖2a），而抑制NSUN2有相反的效果（圖2b）。由于IRF3是I型干擾素應答啟動過程中的*終因素，文章推測NSUN2可能在IRF3節點上發揮其功能。免疫印跡分析顯示，外源性NSUN2表達可以抑制內源性IRF3水平增強（2c），相比之下，內源性TBK1蛋白水平沒有明顯變化。此外，敲除NSUN2促進了IRF3 Ser396的磷酸化水平，對TBK1 Ser172的磷酸化水平則無促進效果（圖2e，f）。這些結果表明，NSUN2的缺失可以提高IRF3蛋白的整體水平及其磷酸化水平。qPCR分析結果顯示IRF3是NSUN2調控干擾素反應的主要下游靶點（圖2g）。因此，文章進一步使用IRF3?/?Irf7?/?mef，將NSUN2和IRF3-FL與VSV或HSV-1**共轉染，發現NSUN2對病毒繁殖的促進依賴于IRF3的存在（圖2h）。綜上所述，這些結果表明，NSUN2可以特異性抑制IRF3的表達，從而負調控病毒**后的I型干擾素應答。
圖2.NSUN2抑制IRF3的表達水平
3、NSUN2催化IRF3 mRNA的m5 C甲基化
文章推測NSUN2可能與IRF3 mRNA發生物理上的相互作用。CO-IP和WB結果顯示，在HEK293T中，NSUN2和IRF3蛋白之間沒有相互作用（圖3a）。文章進一步在SeV刺激的HEK293T細胞中過表達并免疫沉淀NSUN2蛋白，并對其進行RNA提取和qPCR。結果顯示，NSUN2確實與內源性IRF3 mRNA結合，而內源性TBK1 mRNA不與NSUN2相互作用（圖3b），敲除NSUN2提高了內源性IRF3 mRNA水平，而內源性TBK1 mRNA水平沒有受到影響(圖3c，d）。隨后，文章檢測了野生型和NSUN2mRNA2?/?HEK293T細胞內源性IRF3 mRNA的半衰期，結果發現，敲除NSUN2**提高了IRF3 mRNA的半衰期（圖3e）。此外，文章使用HA-tag抗體從NSUN2-/- HEK293T中沉淀HA-NSUN2蛋白，并重組外源性HANSUN2（圖3f）。綜上結果表明，NSUN2主要通過與IRF3 mRNA結合并加速其降解來降低IRF3蛋白水平。
使用重組GST-NSUN2和3h標記的S-腺苷蛋氨酸（SAM）對這些RNA進行體外甲基化分析。與RIG-I、MAVS和TBK1的轉錄本相比，轉錄后的IRF3 mRNA可被NSUN2高度甲基化（圖4a，b）。這些數據表明，與RIG-I、MAVS和TBK1 mRNA相比，NSUN2可以在體外有效地介導IRF3 mRNA的甲基化。為了確定哪個區域可能被甲基化，文章將IRF3 mRNA分為7個部分（圖4a），與其他片段相比，IRF3 5‘UTR、3’UTR、CDS2和CDS3被NSUN2高度甲基化（圖4c）。將等量的內源性IRF3 mRNA裝載在細胞膜上，并測定m5 C的水平。m5C merip-seq結果顯示，NSUN2敲除細胞中IRF3 mRNA的m5 C甲基化水平明顯低于野生型細胞（圖4d）。m5C meRIP-qPCR的結果顯示，NSUN2敲除細胞中內源性m5 C甲基化的IRF3 mRNA水平明顯低于野生型細胞，而外源性NSUN2的表達可**提高內源性m5 C-甲基化的IRF3 mRNA水平（圖4e）。隨后，文章進一步通過RNA-seq數據分析了過表達NSUN2的HEK293T細胞或HEK293T細胞中mRNA的表達水平。從這些結果來看，在NSUN2過表達的細胞中，IRF3、IFNB1及其下游的ISGs持續下調（圖4f），而相應的SeV復制增強（圖4g）。然而，上游信號因子如RIG-I（DDX58）、TBK1或MAVS并沒有表現出NSUN2的一致或**調控。這些結果顯示，NSUN2介導的IRF3 mRNA的m5 C甲基化調控了IRF3 mRNA水平和IRF3介導的IFNB1和下游ISGs水平（圖4d,e）。甲基轉移酶突變體C271A能提高NSUN2的催化活性（圖4h）。文章利用LC-MS/MS檢測了轉染了NSUN2或其突變體的NSUN2?/?HEK293T細胞中總RNA（圖4i）或mRNA（圖4j）的m5 C甲基化水平。如圖4(k)所示，與野生型NSUN2相比，I302A或C321A過表達后，SeV誘導-IFN-β熒光素酶檢測中部分抑制能力喪失，而C271A與野生型NSUN2相比可增強抑制能力。此外，在NSUN2?/?HEK293T細胞中，雙突變體I302A/C321A在功能（圖4l）和對IFNB1 mRNA水平的影響（圖4m）方面都完全失去了其抑制能力。
RNA-seq的GO分析結果表明敲除NSUN2有助于免疫應答的**升高，這進一步證明了NSUN2在抗病毒先天免疫應答中的關鍵作用（圖5a）。在A549 NSUN2敲除細胞中，IRF3、IFNB1及其下游ISGs持續上調，而相應的SeV復制受到抑制（圖5b，c）。同時，A549 NSUN2敲除細胞中內源性m5 C甲基化IRF3 mRNA水平**低于A549野生型細胞（圖5d）。
圖3.NSUN2與IRF3 mRNA相互作用并誘導其降解
圖4 NSUN2催化外源性和內源性IRNF3 mRNA m5C甲基化的形成
圖5 敲除NSUN2降低了IRF3 mRNA上的m5 C甲基化，但增加了IRF3和IFNB1以及下游ISGs mRNA水平
4、IRF3 mRNA的甲基化胞嘧啶調節RNA水平
m5C MeRIP-seq轉錄組分析發現了未**或sars-cov-2**的Caco-2細胞中RNA的內源性m5C位點（圖6a）。m5C Bis-seq分析發現（圖6b），IRF3 mRNA中的一個甲基化胞嘧啶是甲基化的主要位點，在體外被重組NSUN2蛋白高度甲基化：5‘UTR中的C169（圖6c）。此外，還發現了另外三個高度甲基化的胞嘧啶：3‘UTR中的C1569，CDS2中的C556（486-735），CDS3中的C815（736-985），與在IRF3 mRNA中觀察到的四個高甲基化區域一致(圖4c ）。進一步研究NSUN2對IRF3 mRNA的m5 C甲基化的生物學功能，如圖6(d)所示，敲除NSUN2可以增加報告基因pGL3-IRF3-5‘UTR、pGL3-IRF3-CDS和pGL3- IRF3-3’UTR的熒光素酶活性。在5‘UTR中觀察到突變C169（C到G），在3‘UTR中觀察到突變C1569（C到G），CDS2（486-735）的C556（C到T，同義突變）和CDS3（736-985）的C815（C到A，同義突變），這四個突變位點在重組NSUN2中的甲基化水平降低了一半。隨后，文章構建了包含野生型IRF3全長（IRF3-fl，1-1595nt）或不同位點突變的IRF3- FLs的表達質粒。發現與野生型IRF3全長（IRF3-FL-WT）相比，這4個胞嘧啶的突變可以持續提高IRF3?/?Irf7?/?mef中IRF3 mRNA的表達水平(圖6f）。位于CDS1（C303）或CDS4（C1135）中的另外兩個胞嘧啶（圖6a）在m5C Bis-seq中未被檢測到，并且對其功能沒有影響（圖6f和g）。綜上所述，研究結果表明，m5C修改的損失可能導致IRF3 mRNA的穩定性和增強IFN-β生產，從而促進更強的抗病毒反應，而IRF3 mRNA高度甲基化胞嘧啶在Nsun2介導的抗病毒反應發揮關鍵作用。
圖6.IRF3 m5 C甲基化位點突變導致IRF3表達增強和抗病毒應答
5、NSUN2在體內誘導I型干擾素和抗病毒應答中的關鍵作用
Nsun2+/?小鼠中Nsun2的表達比野生型同窩小鼠減少了一半（圖7a，b），在**SeV后，Nsun2+/?小鼠的BMDCs中內源性IRF3mRNA水平和蛋白水平均比野生型同窩小鼠中增強（圖7a，b）。此外，如圖7(c)所示，與使用SeV、HSV-1或VSV的野生型小鼠相比，Nsun2+/?小鼠的BMDCs中Ifnb1 mRNA水平**提高了。IFN-β介導的下游Isg15和Cxcl10在Nsun2+/?小鼠的BMDCs中也**增強（圖7d）。因此，在Nsun2+/?小鼠的BMDCs中，SeV、HSV-1或VSV明顯受到抑制（圖7e）。來自Nsun2+/?小鼠或Nsun2+/+小鼠的BMDCs的RNA-seq結果表明，在Nsun2+/?小鼠的BMDCs中，Irf3、Ifnb1和下游ISGs持續升高（圖7f）。同時，Nsun2+/?小鼠相比于Nsun2+/+小鼠，BMDCs中內源性m5 C甲基化的Irf3 mRNA水平更低（圖7g）。然而，mRNA上Rig-i、Tbk1或Mavs沒有**的m5 C修飾信號。在Nsun2+/?小鼠的BMDCs中，內源性IRF3 mRNA的穩定性更高（圖7h）。隨后，文章研究了野生型小鼠和Nsun2+/?小鼠的先天抗病毒應答。結果發現，在mRNA水平上，相比于野生型小鼠，Nsun2+/?小鼠不同**中的IFN-β產量更高，VSV的病毒負荷更低（圖7i）。并且在ELISA腹腔注射VSV后，Nsun2+/?小鼠的血清中IFN-β和IFN-α的產生**升高（圖7j）。此外，文章還比較了腹腔注射VSV后的生存率。結果表明，野生型小鼠比Nsun2+/?小鼠更容易發生VSV觸發的死亡（圖7k）。
文章進一步研究了SARSCoV-2**的K18-hACE2基因敲入（KI）小鼠模型的先天免疫應答和NSUN2的表達水平。研究發現SARS-CoV-2 WT菌株（圖8a）或BA.1 omicron變異（圖8b）**了K18-hACE2 KI小鼠模型中的先天免疫反應。SARS-CoV-2 WT菌株或BA的內源性Nsun2 mRNA水平**降低。與未**組相比，有1個omicron變異**組（圖8a和b）。這些結果與SARS-CoV-2**的Caco-2細胞模型和COVID-19患者相一致，共同表明NSUN2在SARS-CoV-2**中起著重要的調控作用（圖1n和o）。
圖7.NSUN2在體內誘導I型干擾素和抗病毒應答中的關鍵作用
圖8.SARS-CoV-2**降低了K18-hACE2 KI小鼠的Nsun2表達水平，并**了先天免疫應答
總 結
本研究通過m5C MeRIP-seq、RNA-seq、m5C Bis-seq等多種技術的聯合分析，發現在病毒**過程中，內源性NSUN2的表達水平降低，因此IRF3 mRNA的m5 C修飾水平降低，但穩定性增加。因此，IRF3的表達水平提高，允許更強的干擾素反應和有效的消除病毒。這種重要的宿主抗病毒策略來調節干擾素反應的進化表明，NSUN2介導的m5 C修飾具有重要的生理意義。
云序生物m5C甲基化研究五大模塊
01 m5C RNA甲基化測序m5C RNA甲基化測序（m5C-seq）
對m5C RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m5C-Seq技術，適用于m5C RNA甲基化譜研究，快速篩選m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m5C測序：
m5C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
m5C LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
m5C Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
m5C mRNA測序
02 檢測整體m5C RNA甲基化水平
LC-MS/MS檢測整體RNA甲基化水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
03 m5CRNA甲基化上游酶的篩選
m5CRNA甲基化相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m5C RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m5C RNA甲基化靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05 機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
云序生物服務優勢
優勢一：云序累計支持客戶發表 100 + 篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子 960 +優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：可檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：提供m5C一站式服務：m5C整體水平檢測、m5C-seq、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優勢五：超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：提供多種 RNA 修飾測序服務，包含m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
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