云序新品| 分子標志物利器 cfRNA 測序一站式服務

對生物體液中的生物標志物的分析，也常被稱為液體活檢。液體活檢有巨大的基礎研究和臨床使用潛力，能以高靈敏度和低侵入性的方式對疾病進行診斷和預后分析。大多數液體活檢研究都集中在血循環當中的核酸上。歷史上，cfDNA ***先進入研究者的視野，但*近一些年來，cfRNA 的研究也逐漸獲得了關注。

cfRNA是什么
cfRNA（Cell-free RNA）是位于細胞外的游離 RNA分子。這些分子在正常生理過程或病理條件下被細胞釋放。cfRNA已成為各種疾病當中極有前途的生物標志物，包括**、多種傳染病、心血管疾病和神經系統疾病等等。
cfRNA 由多種類型的 RNA 構成，根據分子長度的不同，cfRNA大致可以劃分為兩大類：小RNA和長RNA。小RNA長度約為 18-40 nt，*長不超過 200 nt。因為它們都是非編碼 RNA，因此也被稱為 sncRNA（Small Non-coding RNA）。cfRNA 當中的小 RNA 包括以下幾種主要亞型：微小RNA（miRNA）、piwi相互作用RNA（piRNA）、tRNA衍生的小RNA（tsRNA）還有 rRNA 衍生的小 RNA（rsRNA）。另一方面，長RNA的長度則往往可以達到數百到數千nt，主要包括mRNA、長非編碼RNA（lncRNA）和環狀RNA（circRNA）。

cfRNA的來源樣品
凡是來源于細胞外的游離 RNA 分子都屬于 cfRNA 大家庭。在臨床上*常見的 cfRNA 樣品來源就是血漿和血清，這類樣品當中不存在細胞結構，但含有豐富的游離核酸，其中就包括 cfRNA。除了血漿和血清以外，尿液、腦脊液、**溢液、玻璃體液等不含細胞結構的體液樣品也可以作為 cfRNA 的來源。此外，即便某些體液當中存在細胞結構（例如全血、**），我們仍然可以先行分離其中的外泌體，得到這些體液樣品當中外泌體來源的 cfRNA。這一樣品獲取思路還不**局限于體液，對于培養細胞的上清乃至是組織樣品，也都可以考慮獲取其外泌體來源的 cfRNA?？傊?，cfRNA 的來源樣品極其豐富，許多類型的樣品均可進行 cfRNA 測序實驗。

cfRNA中常見的分子類型
miRNA
miRNA 是一類研究得比較早的小 RNA。miRNA *初的轉錄產物前體是長鏈的 pri-miRNA，隨后被剪接為長度約數十到百余 nt 的發夾形 pre-miRNA，*終被加工為長度約 18-24 nt 的成熟 miRNA。miRNA參與調節基因表達，通過結合目標mRNA抑制其翻譯或促進其降解。

miRNA 參與各種生物過程的調控，包括發育、細胞增殖和凋亡。miRNA表達失調已被證明與各種疾病的發病機制相關，包括**、心血管疾病和神經系統疾病。例如：
1.**：多項研究顯示，miR-21在乳腺*、肺*、結腸*和胰腺*中過表達，而 miR-205在乳腺*中下調。這些 miRNA 可作為**診斷的潛在生物標志物。
2.心血管疾?。簃iR-1和miR-133a在心肌中表達，在心力衰竭中下調，使它們成為潛在的診斷生物標志物。此外，miR-208b已被證明是心肌梗塞的生物標志物。
3.神經系統疾?。簃iR-9、miR-29b和miR-132在阿爾茨海默病中被下調，使它們成為診斷該病的潛在生物標志物。此外，miR-124在帕金森病中被下調，使其成為診斷的潛在生物標志物。

piRNA
piRNA是一類長度約 24-32 nt 的小 RNA，早期主要在生殖細胞發育的背景下研究。它們通過與 PIWI 蛋白的結合形成 RISC 復合物，參與轉座子的沉默和維持基因組穩定性。

*近的研究表明，piRNA也存在于體細胞中，并可能在這些細胞中發揮調節基因表達的作用，并且在**和神經退行性疾病等多種疾病當中發揮作用：

1.**：piRNA-651 促進乳腺*和非小細胞肺*的發生，piR-823 則在食管鱗*當中發揮作用，piR-1245 則有在結直腸*當中發現。
2.神經退行性疾?。簆iR-38240 and piR-34393 在阿茲海默癥當中上調，血液外泌體當中的 piR-has-92056, piR-hsa-150797, piR-hsa-347751, piR-hsa-1909905, piR-hsa-2476630, and piR-hsa-2834636 等多種 piRNA 則可以用作帕金森病的生物標志物。

tsRNA
tsRNA（tRNA-derived small RNA）是源于 tRNA 的小片段，由酶切割tRNA或者tRNA前體所產生，根據切割片段的來源和長度的不同，可細分為tRF、tiRNA、tRNA halves等。

研究顯示，tsRNA 擁有豐富的生物學功能，至少包括：
1.調控 mRNA 穩定性。tsRNA具有類似于miRNA的功能，可以通過靶向mRNA來調節其穩定性，從而調節mRNA的穩定性。
2.調控蛋白質翻譯。tsRNA 調節蛋白質翻譯有以下幾種方式：
（1）增強翻譯過程：在小鼠和人類的研究中，tsRNA LeuCAG可以與編碼核糖體蛋白RPS28的mRNA結合，從而增強翻譯過程；
（2）抑制翻譯過程：tsRNA能夠與核糖體小亞基16S rRNA結合，從而抑制翻譯過程；
（3）調控翻譯起始：tsRNA能夠形成多聚體，代替翻譯起始因子eIF4復合物，從而抑制翻譯起始過程。
3.tsRNA作為表觀遺傳調控因子，可以通過影響不同的表觀遺傳過程來調節基因的表達。例如，tsRNA可以與PIWI蛋白相互作用，促進H3K9甲基化。
4.tsRNA可以通過與成熟tRNA競爭結合到反轉錄轉座子的引物結合位點上，阻斷其逆轉錄，從而調節轉座子的活性。
研究顯示 tsRNA 參與調節基因表達和壓力應對。tsRNA 在壓力或細胞損傷條件下生成，在多種疾病中其表達增加。因此，tsRNA 可以作為疾病的分子標志物。迄今為止，已經有研究顯示 tsRNA 在以下類型的疾病當中作為生物標志物：
1.病毒**：在HBV或HCB病毒**的組織細胞中，tsRNA的豐度會發生**變化。
2.應激反應：tsRNA在急性炎癥、衰老、能源限制、急性腎臟疾病和組織損傷等情況下，對外周循環具有敏感性，因此可能是一種有用的非侵入性生物標志物。
3.**：已有研究表明，在多種**中，tsRNA受到異常調節。這些異常調節的tsRNA可能成為疾病診斷、靶向**和預后等方面的生物標志物。
4.神經退行性疾?。簍sRNA 在帕金森病、腦橋小腦發育不全、肌萎縮性側索硬化癥、阿茲海默癥和其他神經退行性疾病的患者中發生改變。


rsRNA
除了 tRNA 以外，另一種豐富極高的管家 RNA 也能衍生出一些小 RNA，那就是 rRNA 所衍生出的 rsRNA。研究顯示，rsRNA成熟的精細胞以及多種體細胞中都存在。rsRNA 和 tsRNA 一起構成了特定種類細胞的“coding signature”。目前關于 rsRNA 的研究還不多，但由于其與 tsRNA 相似的大小和生成機制，因此測序方法和數據分析方法可以基本沿用。我們完全可以預期 rsRNA 的研究涌現出更多成果來。

總之，包括miRNA、piRNA、tsRNA 和 rsRNA 在內的 sncRNA，是可能作為各種疾病生物標志物的重要分子。這些 sncRNA 在血液、尿液、腦脊液等體液當中**以 cfRNA 的形式存在，因此檢測 cfRNA 當中的 sncRNA 是研究疾病分子標志物的一條捷徑。
那么，cfRNA 當中是否也存在長鏈 RNA 呢？在一般的認識當中，人們普遍認為血液等體液當中很少存在長鏈 RNA，因此很難作為疾病分子標志物。然而，近來的多項研究顯示，長鏈 RNA 亦可存在在于細胞外的體液當中，其中不乏一些長鏈 cfRNA 具有作為生物標志的潛力。以下我們就帶來幾篇長鏈 cfRNA 研究的例子：

circRNA
環狀 RNA 因為不存在暴露的 5’ 端或 3’ 端，可以耐受 RNA 外切酶，具有比較穩定的結構，有利于其在體液當中的長期存在。因此，在長鏈 cfRNA 當中，circRNA 是*常見的研究對象。
circRNA 在各種疾病中均表現出不同程度的異常表達，包括**、心血管疾病、神經退行性疾病等。例如：
1.**：多項研究表明，circRNA 在多種**類型中表達異常，包括肝*、胃*、乳腺*、肺*和結直腸*等。一些 circRNA 已被確定為**的潛在診斷生物標志物，如乳腺*中的 hsa_circ_0000520，胃*中的 hsa_circ_0005075 和結直腸*中的 hsa_circ_0012673。
2.心血管疾?。篶ircRNA 已被發現參與心肌梗死、心力衰竭和******等心血管疾病的發生和發展。例如，hsa_circ_0001879 已被確定為急性心肌梗死的診斷生物標志物，而 hsa_circ_0001445 和 hsa_circ_0004104 被認為是心力衰竭的潛在生物標志物。
3.神經退行性疾?。篶ircRNA 異常表達在多種神經退行性疾病中被觀察到，如阿茨海默病、帕金森病和多發性硬化癥等。一些 circRNA 被確定為這些疾病的潛在診斷生物標志物，如阿茨海默病中的 hsa_circ_0001445 和帕金森病中的 hsa_circ_0004358。

mRNA
cfRNA 當中也能檢測到像 mRNA 這樣的長鏈 mRNA。例如，在云序客戶的一項研究當中，研究者在帕金森病患者和健康組志愿者的血漿外泌體當中進行了全轉錄組測序，發現了包括 NDUFB7 基因的 mRNA 轉錄本 ENSG00000099795 在內的多個長鏈 RNA 轉錄本在帕金森病人的血漿當中**上調。

lncRNA
長鏈非編碼 RNA（lncRNA）在 cfRNA 也占有一席之地。例如，云序客戶的一項研究當中發現，LUCAT1是一個*初發現于吸煙相關的肺*當中的 lncRNA。在該項研究中當中，研究人員在肺腺*患者的血清外泌體中發現了LUCAT1 的上調現象。用這個 lncRNA 作為肺腺*的分子標志物，AUC 可以高達 0.852。作者還通過后續的一系列實驗，發現了 LUCAT1/miR-4316/VEGF-A 調控軸。

cfRNA研究典型案例

論文標題：A urine extracellular vesicle circRNA classifier for detection of high-grade prostate cancer in patients with prostate-specific antigen 2–10 ng/mL at initial biopsy
發表期刊：Molecular Cancer（IF=41.444）
樣品類型：尿液外泌體
測序樣品數：11+11
訓練集樣品數：72+191
驗證集樣品數：497 & 505
研究者對 11 個高級別前列腺*（high-grade prostate cancer）患者和 11 個輕度前列腺增生患者的尿液外泌體當中的 cfRNA 進行了測序，發現了 18 個 circRNA 在前列腺*患者組當中**上調。隨后研究者擴大樣本數量，在 72 個疾病組和 191 個對照組個體的尿液外泌體當中通過 ddPCR 定量確認了這 18 個 circRNA 在疾病組當中的上調。作者隨后基于這些 circRNA 訓練了多個分類模型，其中效果***好的一個分類模型（文中稱為“Ccirc”）在訓練集當中的 AUC 高達 0.820，擁有**的高級別前列腺*區分能力。**作者又在兩個**的驗證集當中（數量分別高達 497 和 505）對訓練出的分類模型進行了驗證，結果發現 Ccirc 這個分類模型均擁有超過 0.8 的 AUC 值。相比于現行wei一臨床可用的高級別前列腺*生物標志物 PSA，該分類模型可以在更低濃度下進行檢測，相當于*需 2.0–10.0 ng/mL 濃度的 PSA 即可有效區分出高級別前列腺*患者。

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• cfRNA tsRNA測序（包含tsRNA和miRNA）

• cfRNA piRNA測序 （包含piRNA和miRNA）

1.cfRNA small RNA測序 （包含miRNA，piRNA，tsRNA，rsRNA等多種sncRNA）
對于長鏈 RNA，我們提供以下 cfRNA 測序服務：

• cfRNA mRNA測序

• cfRNA LncRNA測序 （包含mRNA和LncRNA）

• cfRNA  circRNA測序 （包含circRNA，LncRNA和mRNA）

此外，我們還提供包含小 RNA 和長鏈 RNA 雙文庫在內的 cfRNA 全轉錄組測序服務：

• cfRNA 全轉錄組測序 （包含mRNA，lncRNA，circRNA，miRNA，piRNA，tsRNA，rsRNA）

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