用戶文章|環狀RNA測序助力食道鱗狀細胞*的機制研究

環狀RNA在食道鱗狀細胞*（ESCC）等許多*癥中發揮著重要作用，但大多數環狀RNA的確切功能尚不清楚。2023年1月12日，云序客戶山東大學齊魯醫院孫振國團隊在Cell Death Discov（IF=7.109)上發表文章“Circular RNA circTRPS1-2 inhibits the proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma by reducing the production of ribosomes”通過對ESCC組織和鄰近正常組織的研究，揭示了circTRPS1-2可以通過減少核糖體的產生來抑制ESCC的增殖和遷移，從而確立了其在ESCC**和預后預測中的潛在作用。云序生物有幸參與了此項研究中的全轉錄組測序高通量測序技術服務。

發表期刊：Cell Death Discov
影響因子：7.109
發表時間：2023年1月12日
研究方法：全轉錄組測序、環狀RNA RT-PCR、RIP-PCR、RNA pull down等
文章鏈接：Circular RNA circTRPS1-2 inhibits the proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma by reducing the production of ribosomes

云序提供服務：

1.circTRPS1-2在ESCC組織中的表達
對3對ESCC和鄰近的正常組織進行全轉錄組高通量測序，測序所得的circRNA結果發現2685個環狀RNA在*癥中上調，4881個環狀RNA在*癥下調（圖1a，b）。進一步設定差異倍數∣fold change ∣≥2和P < 0.05進行篩選，*終確定了5個上調的環狀RNA和41個下調的環狀RNA（圖1c）。此后，文章用30對**的ESCC和鄰近的正常組織驗證了5個上調的環狀RNA和以下10個下調*多的環狀RNA，hsa_circ_0026782，hsa_circ_0085362（circTRPS 1-2）和hsa_circ_0078299等（圖1d）。

2.ESCC細胞系中circTRPS1-2的下調和亞細胞定位
根據UCSC基因組瀏覽器（GRCh37/hg19）比對結果分析，CircTRPS1-2位于染色體8：116599227-116635985上（圖2a），長2821 bp，由TRPS1基因的第2外顯子與第5外顯子反向剪接產生（圖2b）。此外，circTRPS1-2在K150和E109細胞系中均表達下調（圖2c）。隨后文章作者通過對qRT-PCR產物的Sanger測序，驗證了反向剪切（圖2d）。并且分歧引物能夠從cDNA中擴增circTRPS1-2，但不能從基因組DNA中擴增，而聚合引物能夠從cDNA和基因組DNA中擴增線性TRPS1（圖2e）。這些結果支持了circTRPS1-2是通過反向剪接而不是反式剪接或基因組重排而產生的觀點。circTRPS1-2的環狀結構通過其對RNase R消化的耐受性得到證實（圖2f）。根據circTRPS1-2的FISH（圖2g）和核-細胞質分離（圖2h），發現主要定位在細胞質和細胞核中。

3.ESCC**中circTRPS1-2的下調及其與不良預后的關系
在30例ESCC和對應的鄰近患者的正常組織中，文章發現circTRPS1-2在**中**下調（圖3a）。BaseScope實驗也得到了類似的結果，環狀RNA主要定位于細胞質和細胞核（圖3b，c）。30例患者中，circTRPS1-2表達低于中位水平的患者的3年總生存期明顯低于表達高于中位水平的患者（P = 0.025；圖3d）。這些結果表明，circTRPS1-2可能作為一種抗ESCC的**抑制因子，其低表達預示著預后不良。

圖3  circTRPS1-2在ESCC組織中的下調及其表達與預后呈正相關

4.CircTRPS1-2抑制ESCC細胞系的增殖和遷移
為了研究circTRPS1-2在ESCC細胞中的生物學功能，文章用兩個ESCC細胞系分別轉染過表達circTRPS1-2的質粒和用siRNAs敲除（圖4a）。這些轉染對線性TRPS1的表達沒有**影響（圖4b）。根據集落形成（圖4c，d）、EdU摻入（圖4e，f）和細胞計數試劑盒Kit-8（圖4g）的分析，過表達circTRPS1-2**降低了ESCC細胞的活力和增殖。根據傷口愈合試驗（圖4h，i）和跨孔遷移（圖4j、k），也**降低了ESCC細胞的遷移能力。而敲除circTRPS1-2的效果則相反。
圖片

5.CircTRPS1-2在體內抑制**的發生和轉移
在皮下**實驗中（圖5a），circTRPS1-2的過表達導致**體積（圖5b）和重量（圖5c）明顯變小。敲除circTRPS1-2則產生了相反的作用。在**轉移實驗中，circTRPS1-2的敲除顯示出明顯更多的淺表轉移（圖5d)、肺轉移（圖5e、f)和表面和深部的整體轉移（圖5g）。過表達circTRPS1-2可減少肺轉移（圖5f)和總轉移（圖5g)。

6.CircTRPS1-2可能調節核糖體的生物發生
為了闡明circTRPS1-2可能在ESCC中作為**抑制因子的途徑，在排除了26個正義和反義RNA探針拉下的蛋白質后，文章繼續分析了15個與正義探針特異性結合的蛋白質（圖6a）。GO分析和KEGG分析結果表明，這15個蛋白與核仁和細胞質中的核糖體和核糖核RNA加工密切相關（圖6b，c）。所以文章推測circTRPS1- 2可能參與了核糖體的生物發生，因此文章作者隨后檢測了15個候選相互作用中的5個核糖體蛋白：S4X、S8、S24、L7和L11。**通過RNA pull down下拉后的蛋白印跡實驗證實了circTRPS1-2能直接與這些蛋白結合（圖6d）。此外，使用RIP-PCR（圖6e）以及免疫熒光染色（圖6f），根據260 nm處的吸光度，發現過表達導致細胞提取物中核糖體水平降低，下調較高（圖6g）。電鏡觀察顯示，過表達導致核糖體數量和核仁減少，而敲除后的作用則相反（圖6h）。

文章聯合環狀RNA測序、環狀RNA qRT-PCR、RIP-PCR、RNA pull down等技術證明circTRPS1-2通過與核糖體蛋白相互作用以此調節核糖體的產生并發揮抑瘤作用，并探索circTRPS1-2作為潛在的預后生物標志物和**靶點在ESCC中的作用。

一、 環狀RNA篩選：
1.1  circRNA測序
1.2 全轉錄組測序（同時檢測circRNA、lncRNA、mRNA）

二、環狀RNA驗證

2.1 qRT-PCR
對選定目標RNA分子可進行qPCR檢測服務，包括引物設計與表達鑒定。
2.2 Sanger測序與RNase R酶耐受實驗
對選定的環狀RNA分子進行反式剪切位點引物設計，擴增后Sanger測序驗證環狀；使用RNase R酶處理環狀RNA分子，驗證環狀RNA分子穩定性。

三、 CircRNA功能機制研究

3.1   RIP測序/RIP-qPCR

針對目標蛋白抗體把蛋白-RNA復合物沉淀下來，并對復合物上的RNA進行測序或對目標RNA進行qRCR表達分析。
3.2  RNA pull-down+MS/WB/qPCR/RNA-Seq
設計目標RNA生物探針把相應的結合蛋白質與RNA復合物沉淀下來，蛋白質譜檢測或WB檢測與RNA結合的蛋白。設計目標RNA生物探針把相應的結合蛋白質與RNA復合物沉淀下來，qPCR檢測或RNA-seq檢測與RNA結合的RNA。
3.3  ChIP-seq/ChIP-PCR
檢測轉錄因子或者組蛋白與下游基因的結合情況。

四、CircRNA修飾研究
4.1  m6A/m5C/ac4C/m7G/m1A等修飾
針對環狀RNA各類修飾進行高通量篩選。
4.2  MeRIP-circRNA-PCR驗證
對高通量測序的結果，通過qPCR進行進一步驗證。

相關產品

全轉錄組測序（同時檢測circRNA、lncRNA、mRNA）

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