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體液樣品當中的環狀 DNA 有什么用？云序助力揭示髓母細胞瘤腦脊液eccDNA 的分子標志物潛質
染色體外環狀 DNA（Extrachromosomal DNA，簡稱 eccDNA） 已在許多**當中發現，并且在有些疾病當中可以充當診斷的生物標志物。然而，髓母細胞瘤（ Medulloblastoma ，簡稱 MB）作為一種缺乏早期診斷方式的惡性**，在該疾病當中的 eccDNA 卻尚無研究報道。近期，云序客戶首都醫科大學三博腦科醫院的馬立新課題組在 Frontiers in Oncology 雜志上發表論文，**揭示了髓母細胞瘤患者**組織以及腦脊液當中的 eccDNA 的特征。云序生物有幸參與了該項研究當中的eccDNA 測序以及數據分析工作。
染色體外環狀 DNA（Extrachromosomal DNA，簡稱 eccDNA） 已在許多**當中發現，并且在有些疾病當中可以充當診斷的生物標志物。然而，髓母細胞瘤（ Medulloblastoma ，簡稱 MB）作為一種缺乏早期診斷方式的惡性**，在該疾病當中的 eccDNA 卻尚無研究報道。近期，云序客戶首都醫科大學三博腦科醫院的馬立新課題組在 Frontiers in Oncology 雜志上發表論文，**揭示了髓母細胞瘤患者**組織以及腦脊液當中的 eccDNA 的特征。云序生物有幸參與了該項研究當中的eccDNA 測序以及數據分析工作。
論文標題：Whole-genome sequencing of extrachromosomal circular DNA of cerebrospinal fluid of medulloblastoma
發表期刊：Frontiers in Oncology（5.738）
發表日期：2022 年 11 月 08 日
實驗方法：組織細胞環狀 DNA 測序、體液樣品環狀 DNA 測序、
1、MB 患者**組織和腦脊液中 eccDNA 的檢測
作者收集了 MB 患者的**組織以及腦脊液（Cerebrospinal fluid，簡稱 CSF）以及健康人的對照樣品，并由云序生物分別對組織樣品和腦脊液樣品進行了針對性的 eccDNA 富集實驗。對于**組織樣品，使用了A&A Biotechnology 的 DNA 純化柱進行 eccDNA 純化，并使用外切酶消化殘余的線性 DNA。隨后，富集后的 eccDNA 進行了滾環擴增，超聲波片段化，并建庫測序。對于腦脊液樣品，首先使用外切酶消化線性 DNA，隨后對剩余的環狀 DNA 進行 Tn5 轉座酶處理，打開環狀結構并加上接頭，進而進行 PCR 擴增并建庫測序。在共計 9 份（4 份患者**組織，1 份健康人組織，3 份患者腦脊液，1 份健康人腦脊液）樣品當***檢測到了超過 35179 種不同的 eccDNA，其中各樣品當中平均檢出 6718 種 eccDNA，中位數為 5472。作者還對所有通過測序得到的 eccDNA 成環位點上下游 10 bp 的序列進行了 motif 分析，發現了如圖所示的以三個核苷酸為單位的基序特征。
2、eccDNA 譜的特征
測序實驗檢測到的 eccDNA **來源于各條染色體，但在第 17 號染色體當中具有**的 eccDNA 來源密度。而在早前的研究報道當中，MB 患者的 17 號染色體上有發現 DNA 損傷-修復的現象，這有可能是 eccDNA 產生的原因。eccDNA 來源密度**的染色體則是 Y 染色體，這一現象也與早前的研究報道所吻合。eccDNA 的來源序列在各種基因區域當中都有檢到，但在 5'UTR 和 Alu 重復元件當中相對較密集，在內含子區域當中相對較稀疏。eccDNA 的長度在 32 到 7,239,203 bp 之間，其中由 16 種（占全部 eccDNA 的 0.4548%） eccDNA 的長度超過 1 MB，而多達 99.77% 的 eccDNA 長度在 2kb 以下。eccDNA 的中位數長度，在組織樣品當中為 272 bp、在腦脊液樣品當中則為 279 bp。兩類樣品當中的均觀測到大約位于 201 bp 和 360 bp 位置的兩個 eccDNA 長度分布峰。
測序實驗中檢測到 47.50% 的 eccDNA 與基因編碼區存在重疊關系。97.87% 的 eccDNA *與單個基因存在匹配關系，但仍有少量的 eccDNA 來源于多個基因的片段，例如存在 8 個基因含有多達 15 個基因的片段來源。有 77.35% 的基因的片段出現在了大于等于兩種 eccDNA 上，而第 7 號染色上長度高達 2.3 MB 的 CNTNAP2 基因則形成了多達 43 種不同的 eccDNA。作者還對各條染色體上的 eccDNA 密度和基因密度做了關聯分析，發現 eccDNA 的密度與基因分布密度存在正相關關系，而基因密度**的第 17 號染色體上的 eccDNA 來源密度也**。
3、MB **組織與健康組織之間的 eccDNA 組間差異
隨后，作者比較了 4 份 MB **組織和 1 份健康對照組織之間的 eccDNA 組間差異。在兩組樣品共計檢到的 35179 種 eccDNA 當中，多達 24873 種 eccDNA *在**組織中檢測到，而 3553 種 eccDNA *在健康組織當中檢測到，6753 種 eccDNA 則在兩組當中都有發現。在長度方面，總體而言，健康組織當中的 eccDNA 長度比**組織當中的更短。在豐度方面，各樣品之間的 eccDNA 豐度并無**差異。
4、MB 患者的**組織與腦脊液之間的 eccDNA 組間差異
隨后，作者比較了 3 位 MB 患者的**組織及相同患者的腦脊液樣品當中的 eccDNA 特征。對于每一位單獨的患者而言，其 MB **組織與腦脊液當中的 eccDNA 數目、長度分布特征以及染色體來源特征上都比較接近。因為 MB 患者**組織和腦脊液中 eccDNA 特征的相似性，作者認為腦脊液將可取代**組織取樣，在 MB 患者的當中作為 eccDNA 檢測的**樣品類型。
5、MB 患者腦脊液與健康人腦脊液之間的 eccDNA 組間差異
作者對 MB 患者和健康人的腦脊液樣品之間的組間差異 eccDNA 基因進行了 GO 和 KEGG 通路分析。
GO 富集分析顯示，MB 患者腦脊液中上調的 eccDNA 基因在生物學功能（BP）方面富集于樹突發生（dendrite development）、軸突發生（axongenesis）、細胞分化中的形態發生調控（regulation of cell morphogenesis involved in differentiation），在細胞組分（CC）方面富集于谷氨酸能突觸（glutamatergic synapse）、陽離子通道復合體（cation channel complex）、離子通道復合體（ion channel complex）等條目，在分子功能（MF）方面面富集于 Ras G 蛋白結合（Ras GTPase binding）、小 G 蛋白結合（small GTPase binding）、鈣調蛋白結合（calmodulin binding）等條目。類似地，在 MB 患者腦脊液中下調的 eccDNA 基因在生物學功能（BP）方面富集于跨膜例子轉運調控（regulation of ion transmembrane transport）、軸突發生（axongenesis）、樹突發生（dendrite development）等條目，在細胞組分（CC）方面富集于陽離子通道復合體（cation channel complex）、離子通道復合體（ion channel complex）、跨膜轉運復合體（transmembrane transporter complex）等條目，在分子功能（MF）方面面富集于小 G 蛋白結合（small GTPase binding）、 Ras G 蛋白結合（Ras GTPase binding）鈣調蛋白結合（calmodulin binding）等條目。
KEGG 通路分析則顯示，MB 患者腦脊液當中上調的 eccDNA 基因富集于軸突引導（ Axon guidance pathway ）、Rap1 信號（Rap1 signaling pathway）、膽堿能突觸（Cholinergic synapse pathway）等通路，MB 患者腦脊液當中下調的 eccDNA 基因富集于 ErbB 信號（ErbB signaling pathway）、GnRH 分泌（GnRH secretion pathway）、局灶性粘附（Focal adhesion pathway）等通路。
6、從 MB 患者和健康人的腦脊液中差異 eccDNA 基因中發現總生存期關的 Hub 基因
作者在 MB 患者和健康人的腦脊液樣品中分析了特有的 eccDNA，發現了 380 個 eccDNA 在 MB 患者的腦脊液中均存在，但沒有出現在健康人的腦脊液樣品當中。這 380 個 eccDNA 中含有 220 個基因來源片段，作者將這 220 個基因與 GSE85217（MB 組織的 mRNA 芯片數據） 和 GSE124814 （1350 份 MB 患者以及 291 份正常腦組織的 mRNA 芯片數據）這兩個基因集取交集，得到了 161 個基因用于后續的分析。GSE85217 當**記錄了 337 位 MB 患者的臨床生存信息，故被用于后續的生存分析。依據單變量 Cox 回歸模型，共計有 21 個與總生存期（OS）**相關的 Hub 基因；多變量 Lasso-penalized Cox 分析則確定了18個基因；*終共有 10 個基因被選用建立預后模型，它們包括：MSH6, NUP85, TBCK, HERPUD2, ZNF750, BAIAP2L1, IFNGR2, FAM172A, FBXO45 和 CFLAR。作者在 GSE124814 中比較了 MB 患者和正常腦組織之間基因表達差異情況，發現前述的 10 個基因當中有 9 個存在**的組間表達差異。單變量 Cox 回歸模型顯示，這 10 個基因都可作為**的 MB 總生存期預后指標，因此作者*終將這 10 個基因全部用于一個 MB 風險分數模型。
7、建立 Hub 基因的預后特征
使用 R 包 "survival" 計算 Hub 基因的表達值，作者將這個計算結果定義為“風險分數”（Risk score）。以風險分數中位數作為閾值，將 337 個 MB 患者區分為高風險組和低風險組。使用 KM 生存曲線來比較高風險組和低風險組的總生存期，發現存在**組間差異。MSH6、NUP85、IFNGR2、FBXO45 等幾個基因與總生存期呈負相關關系，而 TBCK、HERPUD2、BAIAP2L1 等幾個基因則與總生存期呈正相關關系。為了檢驗 Hub 基因的預后預測能力，作者繪制了 ROC 曲線，發現 1 年、3 年、10 年生存期的 AUC 面積分別達到了 0.759, 0.799 和 0.781，顯示出良好的預測能力。至于 Hub 基因對 MB 的診斷能力，ROC 曲線結果顯示，AUC 面積超過了 80%，說明 hub 基因對于 MB 的診斷效果**。對高風險組和低風險組的總生存期和 10 個基因的表達進行的比較顯示，高風險組與較差的預后相關。Hub 基因的熱圖也顯示，上調基因與較差的預后相關。
8、預測性列線圖的構建和驗證
作者隨后還考量了年齡、性別、**轉移、分子亞型對于預后模型的影響，單變量和多變量 Cox 回歸分析都顯示，除了風險分數以外，年齡和**遷移都是影響 MB 患者總生存期的**影響因素。隨后，作者使用風險分數、年齡、**轉移、預后參數以及其他相關臨床數據，構建了一個用于預測 MB 患者 3/5/10 年總生存期的預測性列線圖。該列線圖與實際的 3/5/10 年總生存期大體上保持一致，表現出良好的可靠性。
1.組織細胞環狀DNA測序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號，高效地純化和富集環狀DNA，再利用NGS測序和生信分析識別環狀DNA。結合優化的實驗流程，本環狀DNA測序服務具有檢出率高﹑準確性好等優點。
技術優勢：
使用原裝A&A Biotechnology純化柱高效富集環狀DNA
滾環擴增放大環狀DNA信號，提高檢出率
專業的生信分析：詳盡的注釋、豐富的圖表
2.體液樣品環狀DNA測序
針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品，云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開eccDNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高，損耗低，實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量，使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。
技術優勢：
減少DNA損失
保留原始表達量，不同環狀DNA間表達量比較更準確
3.體液樣品環狀DNA甲基化測序
針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品，云序參考盧煜明教授團隊 2021 年研發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開環狀DNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，并用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U，進行建庫及測序。一次建庫測序中同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化位點的信息。
技術優勢：
一箭雙雕：同時檢測環狀DNA及其甲基化狀況，節約樣品，性價比高
單堿基分辨的環狀DNA甲基化分析
4.環狀DNA sanger測序
針對測序項目中篩選出的環狀DNA，云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。其主要目的在于：為用戶提供一種低成本的擴大樣品量驗證手段，節約實驗成本。通過設計反向引物進行PCR擴增，將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序，驗證連接位點處序列。
5.A&A Biotechnology 環狀 DNA 純化柱
A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分環狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內的**總代理。
優勢二：擁有包括組織細胞/體液樣品環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序在內豐富的環狀DNA測序產品線。
優勢三：A&A Biotechnology 總代理，采用原裝A&A Bio純化柱，環狀DNA 純化效果好。
優勢四：一站式服務：您只需按照送樣要求向云序生物寄送樣品，我們就能為您完成從環狀DNA 提取，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。
優勢五：嚴格質控流程：云序生物質控流程嚴格，層層把關，為客戶提供高準確度的結果。
優勢六：專業化生物信息分析：云序生物強大生物信息團隊，滿足客戶個性化數據分析要求。
往期回顧
發表期刊：Frontiers in Oncology（5.738）
發表日期：2022 年 11 月 08 日
實驗方法：組織細胞環狀 DNA 測序、體液樣品環狀 DNA 測序、
1、MB 患者**組織和腦脊液中 eccDNA 的檢測
作者收集了 MB 患者的**組織以及腦脊液（Cerebrospinal fluid，簡稱 CSF）以及健康人的對照樣品，并由云序生物分別對組織樣品和腦脊液樣品進行了針對性的 eccDNA 富集實驗。對于**組織樣品，使用了A&A Biotechnology 的 DNA 純化柱進行 eccDNA 純化，并使用外切酶消化殘余的線性 DNA。隨后，富集后的 eccDNA 進行了滾環擴增，超聲波片段化，并建庫測序。對于腦脊液樣品，首先使用外切酶消化線性 DNA，隨后對剩余的環狀 DNA 進行 Tn5 轉座酶處理，打開環狀結構并加上接頭，進而進行 PCR 擴增并建庫測序。在共計 9 份（4 份患者**組織，1 份健康人組織，3 份患者腦脊液，1 份健康人腦脊液）樣品當***檢測到了超過 35179 種不同的 eccDNA，其中各樣品當中平均檢出 6718 種 eccDNA，中位數為 5472。作者還對所有通過測序得到的 eccDNA 成環位點上下游 10 bp 的序列進行了 motif 分析，發現了如圖所示的以三個核苷酸為單位的基序特征。
2、eccDNA 譜的特征
測序實驗檢測到的 eccDNA **來源于各條染色體，但在第 17 號染色體當中具有**的 eccDNA 來源密度。而在早前的研究報道當中，MB 患者的 17 號染色體上有發現 DNA 損傷-修復的現象，這有可能是 eccDNA 產生的原因。eccDNA 來源密度**的染色體則是 Y 染色體，這一現象也與早前的研究報道所吻合。eccDNA 的來源序列在各種基因區域當中都有檢到，但在 5'UTR 和 Alu 重復元件當中相對較密集，在內含子區域當中相對較稀疏。eccDNA 的長度在 32 到 7,239,203 bp 之間，其中由 16 種（占全部 eccDNA 的 0.4548%） eccDNA 的長度超過 1 MB，而多達 99.77% 的 eccDNA 長度在 2kb 以下。eccDNA 的中位數長度，在組織樣品當中為 272 bp、在腦脊液樣品當中則為 279 bp。兩類樣品當中的均觀測到大約位于 201 bp 和 360 bp 位置的兩個 eccDNA 長度分布峰。
測序實驗中檢測到 47.50% 的 eccDNA 與基因編碼區存在重疊關系。97.87% 的 eccDNA *與單個基因存在匹配關系，但仍有少量的 eccDNA 來源于多個基因的片段，例如存在 8 個基因含有多達 15 個基因的片段來源。有 77.35% 的基因的片段出現在了大于等于兩種 eccDNA 上，而第 7 號染色上長度高達 2.3 MB 的 CNTNAP2 基因則形成了多達 43 種不同的 eccDNA。作者還對各條染色體上的 eccDNA 密度和基因密度做了關聯分析，發現 eccDNA 的密度與基因分布密度存在正相關關系，而基因密度**的第 17 號染色體上的 eccDNA 來源密度也**。
隨后，作者比較了 4 份 MB **組織和 1 份健康對照組織之間的 eccDNA 組間差異。在兩組樣品共計檢到的 35179 種 eccDNA 當中，多達 24873 種 eccDNA *在**組織中檢測到，而 3553 種 eccDNA *在健康組織當中檢測到，6753 種 eccDNA 則在兩組當中都有發現。在長度方面，總體而言，健康組織當中的 eccDNA 長度比**組織當中的更短。在豐度方面，各樣品之間的 eccDNA 豐度并無**差異。
4、MB 患者的**組織與腦脊液之間的 eccDNA 組間差異
隨后，作者比較了 3 位 MB 患者的**組織及相同患者的腦脊液樣品當中的 eccDNA 特征。對于每一位單獨的患者而言，其 MB **組織與腦脊液當中的 eccDNA 數目、長度分布特征以及染色體來源特征上都比較接近。因為 MB 患者**組織和腦脊液中 eccDNA 特征的相似性，作者認為腦脊液將可取代**組織取樣，在 MB 患者的當中作為 eccDNA 檢測的**樣品類型。
5、MB 患者腦脊液與健康人腦脊液之間的 eccDNA 組間差異
作者對 MB 患者和健康人的腦脊液樣品之間的組間差異 eccDNA 基因進行了 GO 和 KEGG 通路分析。
GO 富集分析顯示，MB 患者腦脊液中上調的 eccDNA 基因在生物學功能（BP）方面富集于樹突發生（dendrite development）、軸突發生（axongenesis）、細胞分化中的形態發生調控（regulation of cell morphogenesis involved in differentiation），在細胞組分（CC）方面富集于谷氨酸能突觸（glutamatergic synapse）、陽離子通道復合體（cation channel complex）、離子通道復合體（ion channel complex）等條目，在分子功能（MF）方面面富集于 Ras G 蛋白結合（Ras GTPase binding）、小 G 蛋白結合（small GTPase binding）、鈣調蛋白結合（calmodulin binding）等條目。類似地，在 MB 患者腦脊液中下調的 eccDNA 基因在生物學功能（BP）方面富集于跨膜例子轉運調控（regulation of ion transmembrane transport）、軸突發生（axongenesis）、樹突發生（dendrite development）等條目，在細胞組分（CC）方面富集于陽離子通道復合體（cation channel complex）、離子通道復合體（ion channel complex）、跨膜轉運復合體（transmembrane transporter complex）等條目，在分子功能（MF）方面面富集于小 G 蛋白結合（small GTPase binding）、 Ras G 蛋白結合（Ras GTPase binding）鈣調蛋白結合（calmodulin binding）等條目。
KEGG 通路分析則顯示，MB 患者腦脊液當中上調的 eccDNA 基因富集于軸突引導（ Axon guidance pathway ）、Rap1 信號（Rap1 signaling pathway）、膽堿能突觸（Cholinergic synapse pathway）等通路，MB 患者腦脊液當中下調的 eccDNA 基因富集于 ErbB 信號（ErbB signaling pathway）、GnRH 分泌（GnRH secretion pathway）、局灶性粘附（Focal adhesion pathway）等通路。
6、從 MB 患者和健康人的腦脊液中差異 eccDNA 基因中發現總生存期關的 Hub 基因
作者在 MB 患者和健康人的腦脊液樣品中分析了特有的 eccDNA，發現了 380 個 eccDNA 在 MB 患者的腦脊液中均存在，但沒有出現在健康人的腦脊液樣品當中。這 380 個 eccDNA 中含有 220 個基因來源片段，作者將這 220 個基因與 GSE85217（MB 組織的 mRNA 芯片數據） 和 GSE124814 （1350 份 MB 患者以及 291 份正常腦組織的 mRNA 芯片數據）這兩個基因集取交集，得到了 161 個基因用于后續的分析。GSE85217 當**記錄了 337 位 MB 患者的臨床生存信息，故被用于后續的生存分析。依據單變量 Cox 回歸模型，共計有 21 個與總生存期（OS）**相關的 Hub 基因；多變量 Lasso-penalized Cox 分析則確定了18個基因；*終共有 10 個基因被選用建立預后模型，它們包括：MSH6, NUP85, TBCK, HERPUD2, ZNF750, BAIAP2L1, IFNGR2, FAM172A, FBXO45 和 CFLAR。作者在 GSE124814 中比較了 MB 患者和正常腦組織之間基因表達差異情況，發現前述的 10 個基因當中有 9 個存在**的組間表達差異。單變量 Cox 回歸模型顯示，這 10 個基因都可作為**的 MB 總生存期預后指標，因此作者*終將這 10 個基因全部用于一個 MB 風險分數模型。
7、建立 Hub 基因的預后特征
使用 R 包 "survival" 計算 Hub 基因的表達值，作者將這個計算結果定義為“風險分數”（Risk score）。以風險分數中位數作為閾值，將 337 個 MB 患者區分為高風險組和低風險組。使用 KM 生存曲線來比較高風險組和低風險組的總生存期，發現存在**組間差異。MSH6、NUP85、IFNGR2、FBXO45 等幾個基因與總生存期呈負相關關系，而 TBCK、HERPUD2、BAIAP2L1 等幾個基因則與總生存期呈正相關關系。為了檢驗 Hub 基因的預后預測能力，作者繪制了 ROC 曲線，發現 1 年、3 年、10 年生存期的 AUC 面積分別達到了 0.759, 0.799 和 0.781，顯示出良好的預測能力。至于 Hub 基因對 MB 的診斷能力，ROC 曲線結果顯示，AUC 面積超過了 80%，說明 hub 基因對于 MB 的診斷效果**。對高風險組和低風險組的總生存期和 10 個基因的表達進行的比較顯示，高風險組與較差的預后相關。Hub 基因的熱圖也顯示，上調基因與較差的預后相關。
8、預測性列線圖的構建和驗證
作者隨后還考量了年齡、性別、**轉移、分子亞型對于預后模型的影響，單變量和多變量 Cox 回歸分析都顯示，除了風險分數以外，年齡和**遷移都是影響 MB 患者總生存期的**影響因素。隨后，作者使用風險分數、年齡、**轉移、預后參數以及其他相關臨床數據，構建了一個用于預測 MB 患者 3/5/10 年總生存期的預測性列線圖。該列線圖與實際的 3/5/10 年總生存期大體上保持一致，表現出良好的可靠性。
小 結
本研究在 MB 患者和健康對照者的**組織和腦脊液樣本中對 eccDNA 進行了分析，并鑒定出 MB 患者中富集的 eccDNA 相關基因。eccDNA 在基因組中的分布與基因密度密切相關，符合以往文獻報道的 eccDNA 形成機制。腦脊液中的 eccDNA 表現出與同一樣品來源的 MB **組織相似的特征。但在 MB 患者和正常人之間則有不同的 eccDNA 表達。作者*終選擇了在 eccDNA 數據集和 GEO 數據庫中都很突出的 10 個 Hub 基因，據此將MB 患者分為高風險組和低風險組，并由此建立了一個預后列線圖。本項研究為 MB 組織和腦脊液中 eccDNA 的特點和形成機制提供了初步證據，并發現腦脊液中 eccDNA 相關的 Hub 基因可作為 MB 的診斷和預后生物標志物。
云序生物eccDNA測序
云序生物是國內率先提供環狀DNA測序服務的公司，早在2018年已啟動了環狀 DNA 測序技術的開發。2019年，云序發布了組織細胞環狀 DNA 測序（circle-seq），并成為A&A Bio**代理（該品牌的環狀 DNA 純化柱被絕大部分環狀DNA高分文章采用）。2020年，云序又相繼發布了體液樣品環狀DNA測序及體液樣品環狀DNA甲基化測序服務，擁有豐富的環狀DNA測序產品線。云序生物環狀DNA測序采用雙端測序，上機測序數據量24G。迄今為止，我們已經完成上千例樣品的環狀DNA測序，積累了豐富的項目經驗，樣品類型涵蓋：組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等，物種涵蓋：人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。2021年，云序生物的客戶發表國內首批 eccDNA 研究論文，其中更有發表于 Nature Communications 上的高分研究。
1.組織細胞環狀DNA測序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號，高效地純化和富集環狀DNA，再利用NGS測序和生信分析識別環狀DNA。結合優化的實驗流程，本環狀DNA測序服務具有檢出率高﹑準確性好等優點。
技術優勢：
使用原裝A&A Biotechnology純化柱高效富集環狀DNA
滾環擴增放大環狀DNA信號，提高檢出率
專業的生信分析：詳盡的注釋、豐富的圖表
云序生物eccDNA測序實驗示意圖
針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品，云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開eccDNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高，損耗低，實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量，使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。
技術優勢：
減少DNA損失
保留原始表達量，不同環狀DNA間表達量比較更準確
3.體液樣品環狀DNA甲基化測序
針對血清、血漿、尿液、腦脊液等微量的體液樣品，云序參考盧煜明教授團隊 2021 年研發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開環狀DNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，并用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U，進行建庫及測序。一次建庫測序中同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化位點的信息。
一箭雙雕：同時檢測環狀DNA及其甲基化狀況，節約樣品，性價比高
單堿基分辨的環狀DNA甲基化分析
4.環狀DNA sanger測序
針對測序項目中篩選出的環狀DNA，云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。其主要目的在于：為用戶提供一種低成本的擴大樣品量驗證手段，節約實驗成本。通過設計反向引物進行PCR擴增，將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序，驗證連接位點處序列。
5.A&A Biotechnology 環狀 DNA 純化柱
A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分環狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內的**總代理。
云序生物服務優勢
優勢一：國內率先提供環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序的公司，同時也是**有客戶發表 10 分以上 eccDNA 論文的公司。優勢二：擁有包括組織細胞/體液樣品環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序在內豐富的環狀DNA測序產品線。
優勢三：A&A Biotechnology 總代理，采用原裝A&A Bio純化柱，環狀DNA 純化效果好。
優勢四：一站式服務：您只需按照送樣要求向云序生物寄送樣品，我們就能為您完成從環狀DNA 提取，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。
優勢五：嚴格質控流程：云序生物質控流程嚴格，層層把關，為客戶提供高準確度的結果。
優勢六：專業化生物信息分析：云序生物強大生物信息團隊，滿足客戶個性化數據分析要求。
往期回顧
1區 IF=8.5 云序Circle-seq攜手浙江大學研究者探索卵巢*eccDNA研究
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