用戶文章 IF=17.521|m5C MeRIP-seq助力擬南芥營養發育表觀遺傳機制研究

轉錄后RNA甲基化是真核生物基因調控的一種重要機制，RNA甲基化和組蛋白修飾之間的串擾對哺乳動物的染色質狀態和基因表達至關重要。然而，它在植物中的機制還沒有得到很好的了解。2022年11月16日，云序客戶中國農業科學院生物技術研究所普莉團隊在Advanced Science雜志（IF=17.521）“RNA 5-Methylcytosine Modification Regulates Vegetative Development Associated with H3K27 Trimethylation in Arabidopsis”。該研究發現，EMF1通過不同的表觀遺傳修飾調控營養生長階段相關基因，以影響擬南芥的發育。這揭示了一種新的RNA m5C甲基化修飾參與的表觀遺傳機制，從而為真核生物的基因調控研究提供了新的方向。云序生物有幸參與了此項研究中的m5C MeRIP-seq高通量測序技術服務。

發表期刊：Advanced Science
影響因子：17.521
發表時間：2022年11月16日
研究方法：m5C MeRIP-seq、RNA-seq、ChIP-seq
文章鏈接：RNA 5‐Methylcytosine Modification Regulates Vegetative Development Associated with H3K27 Trimethylation in Arabidopsis

2. EMF1基因敲除導致mRNA m5C整體修飾水平升高
近期研究表明m5C參與了擬南芥的RNA代謝和根發育，以及水稻的光合作用和脅迫響應。
為了研究m5C是否參與了EMF1正向調控光合作用和葉綠體相關基因，作者通過dot blot，LC-MS/MS分析，發現emf1突變體和LFY::asEMF1植株相較于WT植株m5C整體修飾水平升高。接下來，作者通過m5C MeRIP-seq發現與WT植株相比，emf1突變體的m5C位點數量并沒有**變化，而富集程度**增加。此外，作者通過RNA-seq與m5C MeRIP-seq聯合分析發現，在emf1突變體中，大量m5C修飾基因相較WT植株表達水平下調，表明m5C修飾與基因轉錄水平負相關。MeRIP-qPCR及RT-qPCR結果驗證了光合作用和葉綠體相關基因CAO、LHCB5和CHLI1在emf1突變體中m5C甲基化水平上調，表達水平下調。

圖2. WT和emf1突變體中的m5C甲基化

3. EMF1通過H3K27me3修飾抑制淀粉合成基因
前文提到作者發現淀粉在emf1幼苗中過度積累，為了研究EMF1如何影響淀粉的積累，作者分析RNA-seq數據發現，在emf1突變體中，大多數淀粉合成基因（73%）表達上調。接下來，作者通過RT-qPCR驗證了淀粉合成基因蔗糖合成酶1（SUS1）和SUS3在emf1植株中表達上調。此外，ChIP-seq結果顯示，與WT植株相比，emf1突變體中SUS1和SUS3基因的H3K27me3富集**減少，這通過ChIP-qPCR分析進一步證實，表明EMF1確實通過PcG機制抑制了淀粉生物合成基因的表達。

4. RNA m5C修飾與組蛋白H3K27me3修飾負相關
由于EMF1同時介導m5C和H3K27me3修飾，作者接下來探討了m5C和H3K27me3修飾是否在表觀基因組上相互作用。首先，作者分析了擬南芥全基因組甲基化圖譜，發現在emf1突變體中，與WT植株相比，H3K27me3修飾在所有染色體上的富集量均減少，而m5C在所有染色體上的富集量均增加。值得注意的是，m5C甲基化峰更多地富集在H3K27me3稀疏的染色質區域，反之亦然，體現出一種互補分布模式。作者進而研究發現在emf1突變體中，m5C修飾的光合基因表達下調，而H3K27me3修飾的花基因和種子基因表達上調，表明EMF1介導的RNA m5C和H3K27me3修飾分別調控不同的靶基因集。此外，m5C甲基轉移酶TRM4A和TRM4B在emf1突變體中表達水平**升高。ChIP-qPCR分析TRM4B基因，結果顯示TRM4B基因無H3K27me3修飾而有H3K4me3修飾，且emf1突變體中TRM4B的表達水平升高確實與其位點上更豐富的H3K4me3修飾相關。這些結果表明，EMF1通過H3K4me3調控TRM4B的轉錄，而不依賴于PcG介導的H3K27me3機制，并提高m5C甲基轉移酶的表達，從而促進emf1突變體中m5C的修飾。

圖4. RNA m5C修飾與組蛋白H3K27me3修飾負相關

本研究通過m5C MeRIP-seq、RNA-seq、ChIP-seq聯合分析，發現EMF1除了通過PcG機制介導組蛋白H3K27me3修飾發揮抑制作用外，還通過調節擬南芥中TRM4B活性，介導RNA m5C修飾正向調控光合作用和葉綠體相關基因，進而促進營養發育。

01 m5C RNA甲基化測序
m5C RNA甲基化測序（m5C-seq）
對m5C RNA甲基化，目前***的檢測手段為m5C-Seq技術，適用于m5C RNA甲基化譜研究，快速篩選m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m5C測序：

• m5C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

• m5C  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

• m5C  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

• m5C  mRNA測序

02 檢測整體m5C RNA甲基化水平
LC-MS/MS檢測整體RNA甲基化水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
03 m5C RNA甲基化上游酶的篩選
m5C RNA甲基化相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m5C RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m5C RNA甲基化靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05 機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2  RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

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優勢六：提供多種 RNA 修飾測序服務，包含m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。

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