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客戶文章 1區，IF=9.995|m6A甲基化測序助力宮頸*相關HPV病毒研究
2022年10月25日，云序客戶浙江大學醫學院附屬婦產科醫院程曉東教授課題組在Cell Reports雜志上發表了文章“m6A modification confers thermal vulnerability to HPV E7 oncotranscripts via reverse regulation of its reader protein IGF2BP1 upon heat stress”。本文發現，在**HPV的細胞中，病毒E7 mRNA被N6-甲基腺苷（m6A）修飾，并被reader蛋白IGF2BP1穩定。此外，熱處理通過促進IGF2BP1聚集，形成可被泛素蛋白酶復合體系統分
人**瘤病毒（HPV）誘導的*變嚴重依賴于病毒早期蛋白7（E7），這使得E7成為一個有吸引力的**靶點。2022年10月25日，云序客戶浙江大學醫學院附屬婦產科醫院程曉東教授課題組在Cell Reports雜志上發表了文章“m6A modification confers thermal vulnerability to HPV E7 oncotranscripts via reverse regulation of its reader protein IGF2BP1 upon heat stress”。本文發現，在**HPV的細胞中，病毒E7 mRNA被N6-甲基腺苷（m6A）修飾，并被reader蛋白IGF2BP1穩定。此外，熱處理通過促進IGF2BP1聚集，形成可被泛素蛋白酶復合體系統分解的m6A E7 mRNA-IGF2BP1顆粒，特異性下調E7 mRNA-IGF2BP1致*復合物。這為HPV相關惡性**提供了一種基于熱**的**策略。云序生物有幸參與了此項研究中的m6A MeRIP-seq高通量技術服務。
發表期刊：Cell Reports
影響因子：9.995
發表時間：2022年10月25日
研究方法：m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、RNA pull down
文章鏈接：m6A modification confers thermal vulnerability to HPV E7 oncotranscripts via reverse regulation of its reader protein IGF2BP1 upon heat stress
云序生物提供的服務
1. 熱應激下調HPV16 E7 mRNA穩定性
為了初步評估E7的熱敏性，作者使用了HPV16陽性的CaSki和SiHa細胞，發現熱應激以時間和溫度依賴性的方式**下調了E7蛋白及其mRNA的水平（圖1A-B）。無論是蛋白酶體抑制劑MG132，還是溶酶體抑制劑氯喹（CQ）均不能挽救熱處理導致的E7蛋白的下調（圖1C-D），這表明熱應激介導的E7 mRNA的下調是E7*蛋白水平降低的主要原因。此外，作者發現在CaSki或SiHa移植的斑馬魚（圖1G）和裸鼠（圖1H）中，熱處理后E7 mRNA水平下調。熱處理也**降低了hpv16陽性患者**樣本中的E7 mRNA水平（圖1I），這表明通過熱處理來降低HPV16陽性**中的E7具有臨床潛力。
2. 熱應激以m6A依賴的方式下調HPV16 E7 mRNA穩定性
由于m6A修飾是RNA代謝的關鍵調控因子，作者研究了m6A修飾是否參與了熱誘導的E7 mRNA的下調。首先，作者使用SRAMP預測了產生E7*蛋白的主要轉錄本HPV16 E6*1上三個潛在的m6A位點簇（C1、C1和C3）（圖2A）。MeRIP-qPCR結果證實了在CaSki（圖2B）和SiHa細胞（圖2C）以及6例HPV16陽性患者的**樣本中存在這些m6A位點簇。由于m6A修飾主要是由METTL3/METTL14復合物催化，作者用siRNAs敲除METTL14，發現E7轉錄本上的m6A水平**降低，同時E7 mRNA及其蛋白表達水平下調（圖2D）。這些結果表明，m6A對E7 mRNA的穩定性至關重要。重要的是，MeRIP-qPCR結果顯示熱應激**降低了E7 mRNA上m6A修飾，而LC-MS/MS整體甲基化水平檢測發現整體m6A水平無**變化（圖2E-F）。同樣，m6A MeRIP-seq結果顯示其他mRNA，包括CREBBP、RAB21和FBXO41的m6A水平不受溫度升高的影響，進一步表明熱應激選擇性地降低E7 mRNA穩定性。接下來，作者為了進一步確定負責熱敏感性的關鍵m6A位點，構建了一系列E7 mRNA的m6A位點特異性突變轉錄本（圖2G）。結果發現，含有m6A位點簇C3突變的m7 mRNA的穩定性遠低于完整C3區，且熱處理只下調了具有完整C3區域的E7轉錄本及其蛋白產物（圖2H-I）。綜上所述，C3區m6A的修飾對E7 mRNA的穩定至關重要，并在熱應激介導的E7 mRNA及其蛋白產物的下調中發揮了關鍵作用。
3. 熱處理特異性下調E7 mRNA-IGF2BP1致*復合物穩定性
接下來，作者研究了熱處理通過m6A下調E7 mRNA的機制。通過評估高溫對主要的m6A修飾酶的影響，作者發現只有m6A reader蛋白IGF2BP1在熱應激下**降低（圖3A）。MeRIP-qPCR結果顯示沉默IGF2BP1**降低了E7 mRNA上的m6A水平，同時E7 mRNA和蛋白水平**降低（圖3B）。IGF2BP1的過表達穩定E7 mRNA，而IGF2BP1的缺失使E7 mRNA不穩定（圖3C）。此外，RIP-qPCR以及RNA pulldown-WB的結果顯示WT-IGF2BP1，而不是m6A結合缺陷的突變體mut-IGF2BP1結合、穩定并增加了E7 mRNA和蛋白的水平，支持了IGF2BP1以m6A依賴的方式調節E7 mRNA的穩定性的觀點。在熱處理后，IGF2BP1迅速從可溶性提取物轉變為不可溶性顆粒組分隨之泛素化，且E7的消耗在很大程度上抑制了熱應激下可溶性IGF2BP1的減少（圖3E），這表明IGF2BP1的不穩定可能是由于熱誘導的E7依賴的IGF2BP1聚集造成的（圖3E-F）。RIP-qPCR結果顯示熱處理后，E7 mRNA與IGF2BP1的相互作用迅速增強，然后逐漸減少。PLA檢測顯示IGF2BP1的熱刺激泛素化只發生在WT E7表達細胞中，而不是在E7缺失或m6A突變體（m-C3）E7表達細胞中（圖3H），支持了熱介導的IGF2BP1泛素化是通過m6A修飾的E7 mRNA依賴的方式誘導的觀點。與RNA-PLA的結果一致，GFP IGF2BP1在熱處理后迅速形成了顯微鏡下可見的顆粒（圖3J）。
4. 每日熱處理可下調E7和IGF2BP1，并降低HPV陽性細胞的致瘤潛能
接下來，作者探討了熱應激介導的作用是否能抑制HPV16陽性細胞的惡性**。研究表明，每日短期（30 min）輕度熱處理足以下調E7 mRNA及其E7蛋白產物和IGF2BP1蛋白水平，抑制RB和p53蛋白表達，導致p21（p53靶基因）表達上調，PCNA（E2F靶基因）表達下調，減少HPV16陽性細胞增殖和遷移（圖4A-E）。值得注意的是，*在IGF2BP1和WT E7表達的細胞中觀察到熱誘導p21上調、PCNA下調、細胞增殖和遷移減少，而在E7陰性、m6A突變（m-C3）E7和IGF2BP1敲降（IGF2BP1 KD）C33A細胞中未發現（圖4F-G），表明這些熱介導的惡性抑制作用依賴于IGF2BP1和m6A修飾的E7 mRNA。接下來，作者建立了異種移植小鼠模型，并檢測了每日熱處理30天的效果（圖4H）。結果顯示，每日熱處理SiHa而不是C33A異種移植小鼠，**抑制**生長和細胞增殖，下調E7 mRNA、E7蛋白和IGF2BP1蛋白，以及上調RB和p21蛋白（圖4H-K）。綜上所述，每日輕度熱處理可下調E7，抑制**發生，提示其具有臨床潛力。
作者通過m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、RNA pulldown等一系列實驗發現在**HPV的細胞中，病毒E7 mRNA被N6-甲基腺苷（m6A）修飾，并被reader蛋白IGF2BP1穩定。此外，本文研究發現，熱處理選擇性地破壞m6A修飾的HPV E7 mRNA，反向調節IGF2BP1，從而抑制E7介導的HPV陽性細胞的惡性**。
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-meRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
優勢一：云序累計支持客戶發表 84 +篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子 814 +
優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優勢五：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內較全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
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發表期刊：Cell Reports
影響因子：9.995
發表時間：2022年10月25日
研究方法：m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、RNA pull down
文章鏈接：m6A modification confers thermal vulnerability to HPV E7 oncotranscripts via reverse regulation of its reader protein IGF2BP1 upon heat stress
云序生物提供的服務
技術路線
研究內容
1. 熱應激下調HPV16 E7 mRNA穩定性
為了初步評估E7的熱敏性，作者使用了HPV16陽性的CaSki和SiHa細胞，發現熱應激以時間和溫度依賴性的方式**下調了E7蛋白及其mRNA的水平（圖1A-B）。無論是蛋白酶體抑制劑MG132，還是溶酶體抑制劑氯喹（CQ）均不能挽救熱處理導致的E7蛋白的下調（圖1C-D），這表明熱應激介導的E7 mRNA的下調是E7*蛋白水平降低的主要原因。此外，作者發現在CaSki或SiHa移植的斑馬魚（圖1G）和裸鼠（圖1H）中，熱處理后E7 mRNA水平下調。熱處理也**降低了hpv16陽性患者**樣本中的E7 mRNA水平（圖1I），這表明通過熱處理來降低HPV16陽性**中的E7具有臨床潛力。
圖1. 熱處理在體內和體內均下調HPV16 E7轉錄本
2. 熱應激以m6A依賴的方式下調HPV16 E7 mRNA穩定性
由于m6A修飾是RNA代謝的關鍵調控因子，作者研究了m6A修飾是否參與了熱誘導的E7 mRNA的下調。首先，作者使用SRAMP預測了產生E7*蛋白的主要轉錄本HPV16 E6*1上三個潛在的m6A位點簇（C1、C1和C3）（圖2A）。MeRIP-qPCR結果證實了在CaSki（圖2B）和SiHa細胞（圖2C）以及6例HPV16陽性患者的**樣本中存在這些m6A位點簇。由于m6A修飾主要是由METTL3/METTL14復合物催化，作者用siRNAs敲除METTL14，發現E7轉錄本上的m6A水平**降低，同時E7 mRNA及其蛋白表達水平下調（圖2D）。這些結果表明，m6A對E7 mRNA的穩定性至關重要。重要的是，MeRIP-qPCR結果顯示熱應激**降低了E7 mRNA上m6A修飾，而LC-MS/MS整體甲基化水平檢測發現整體m6A水平無**變化（圖2E-F）。同樣，m6A MeRIP-seq結果顯示其他mRNA，包括CREBBP、RAB21和FBXO41的m6A水平不受溫度升高的影響，進一步表明熱應激選擇性地降低E7 mRNA穩定性。接下來，作者為了進一步確定負責熱敏感性的關鍵m6A位點，構建了一系列E7 mRNA的m6A位點特異性突變轉錄本（圖2G）。結果發現，含有m6A位點簇C3突變的m7 mRNA的穩定性遠低于完整C3區，且熱處理只下調了具有完整C3區域的E7轉錄本及其蛋白產物（圖2H-I）。綜上所述，C3區m6A的修飾對E7 mRNA的穩定至關重要，并在熱應激介導的E7 mRNA及其蛋白產物的下調中發揮了關鍵作用。
圖2. 熱處理降低m6a修飾的HPV16 E7轉錄本穩定性
3. 熱處理特異性下調E7 mRNA-IGF2BP1致*復合物穩定性
接下來，作者研究了熱處理通過m6A下調E7 mRNA的機制。通過評估高溫對主要的m6A修飾酶的影響，作者發現只有m6A reader蛋白IGF2BP1在熱應激下**降低（圖3A）。MeRIP-qPCR結果顯示沉默IGF2BP1**降低了E7 mRNA上的m6A水平，同時E7 mRNA和蛋白水平**降低（圖3B）。IGF2BP1的過表達穩定E7 mRNA，而IGF2BP1的缺失使E7 mRNA不穩定（圖3C）。此外，RIP-qPCR以及RNA pulldown-WB的結果顯示WT-IGF2BP1，而不是m6A結合缺陷的突變體mut-IGF2BP1結合、穩定并增加了E7 mRNA和蛋白的水平，支持了IGF2BP1以m6A依賴的方式調節E7 mRNA的穩定性的觀點。在熱處理后，IGF2BP1迅速從可溶性提取物轉變為不可溶性顆粒組分隨之泛素化，且E7的消耗在很大程度上抑制了熱應激下可溶性IGF2BP1的減少（圖3E），這表明IGF2BP1的不穩定可能是由于熱誘導的E7依賴的IGF2BP1聚集造成的（圖3E-F）。RIP-qPCR結果顯示熱處理后，E7 mRNA與IGF2BP1的相互作用迅速增強，然后逐漸減少。PLA檢測顯示IGF2BP1的熱刺激泛素化只發生在WT E7表達細胞中，而不是在E7缺失或m6A突變體（m-C3）E7表達細胞中（圖3H），支持了熱介導的IGF2BP1泛素化是通過m6A修飾的E7 mRNA依賴的方式誘導的觀點。與RNA-PLA的結果一致，GFP IGF2BP1在熱處理后迅速形成了顯微鏡下可見的顆粒（圖3J）。
圖3. E7 mRNA-IGF2BP1復合物對熱應激敏感
4. 每日熱處理可下調E7和IGF2BP1，并降低HPV陽性細胞的致瘤潛能
接下來，作者探討了熱應激介導的作用是否能抑制HPV16陽性細胞的惡性**。研究表明，每日短期（30 min）輕度熱處理足以下調E7 mRNA及其E7蛋白產物和IGF2BP1蛋白水平，抑制RB和p53蛋白表達，導致p21（p53靶基因）表達上調，PCNA（E2F靶基因）表達下調，減少HPV16陽性細胞增殖和遷移（圖4A-E）。值得注意的是，*在IGF2BP1和WT E7表達的細胞中觀察到熱誘導p21上調、PCNA下調、細胞增殖和遷移減少，而在E7陰性、m6A突變（m-C3）E7和IGF2BP1敲降（IGF2BP1 KD）C33A細胞中未發現（圖4F-G），表明這些熱介導的惡性抑制作用依賴于IGF2BP1和m6A修飾的E7 mRNA。接下來，作者建立了異種移植小鼠模型，并檢測了每日熱處理30天的效果（圖4H）。結果顯示，每日熱處理SiHa而不是C33A異種移植小鼠，**抑制**生長和細胞增殖，下調E7 mRNA、E7蛋白和IGF2BP1蛋白，以及上調RB和p21蛋白（圖4H-K）。綜上所述，每日輕度熱處理可下調E7，抑制**發生，提示其具有臨床潛力。
圖4. 每日熱處理可減弱HPV16陽性細胞的致瘤潛能
總 結
作者通過m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、RNA pulldown等一系列實驗發現在**HPV的細胞中，病毒E7 mRNA被N6-甲基腺苷（m6A）修飾，并被reader蛋白IGF2BP1穩定。此外，本文研究發現，熱處理選擇性地破壞m6A修飾的HPV E7 mRNA，反向調節IGF2BP1，從而抑制E7介導的HPV陽性細胞的惡性**。
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-meRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
- m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
- m6A LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
- m6A Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
- m6A mRNA測序
- m6A miRNA測序
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP試劑盒
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq® MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。05 機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP試劑盒篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
云序生物服務優勢
優勢一：云序累計支持客戶發表 84 +篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子 814 +
優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優勢五：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內較全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
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