搜索
取消
清空記錄
歷史記錄
清空記錄
歷史記錄
網站標題
1區，IF=19.16| 云序RNA乙?；瘻y序acRIP-seq助力病毒復制機制研究！
2022年8月16日，云序客戶中國科學院武漢病毒所與深圳大學的研究者們在Nucleic Acids Research（IF=19.16）雜志上發表了文章“N4-acetylcytidine regulates the replication and pathogenicity of enterovirus 71”。本文報道了腸道病毒71(EV71)基因組的5’UTR區存在由宿主乙酰轉移酶NAT10催化產生的ac4C修飾。
N4-乙酰胞苷(ac4C)對mRNA的翻譯和穩定性至關重要。雖然在RNA病毒中發現了ac4C，但ac4C影響病毒復制的詳細機制尚不清楚。2022年8月16日，云序客戶中國科學院武漢病毒所與深圳大學的研究者們在Nucleic Acids Research（IF=19.16）雜志上發表了文章“N4-acetylcytidine regulates the replication and pathogenicity of enterovirus 71”。本文報道了腸道病毒71(EV71)基因組的5’UTR區存在由宿主乙酰轉移酶NAT10催化產生的ac4C修飾。而且，ac4C通過選擇性招募PCBP2到IRES來增強病毒RNA的翻譯，并提高了RNA的穩定性。此外，抑制NAT10和突變ac4C位點抑制了EV71的復制，且ac4c缺陷突變體EV71在小鼠體內表現出的致病性降低。此項研究結果突出說明了ac4C在EV71**中的重要作用，并為潛在的抗病毒治療提供了新的見解。云序生物有幸參與了此項研究中的ac4C acRIP-seq高通量技術服務。
至此我司已經為合作客戶發在Nucleic Acids Research（IF=19.16）、Journal of Hematology & Oncology （IF=23.168）、Advanced Science雜志（IF=17.52）等核心期刊中均提供過ac4C acRIP-seq高通量技術服務以及生信分析。
發表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：19.160
發表時間：2022年8月16日
研究方法：ac4C acRIP-seq、acRIP-qPCR、RIP-qPCR
文章鏈接：N4-acetylcytidine regulates the replication and pathogenicity of enterovirus 71
01 EV71 RNA的5’ UTR中含有ac4C修飾，且宿主NAT10表達模式發生改變
為了研究EV71 RNA是否含有ac4C修飾，作者大規模純化EV71 RNA，并通過UPLC-MS/MS進行定量，發現病毒粒子的EV71 RNA中ac4C殘基占總胞苷的0.201%。此外，針對EV71基因組RNA進行acRIP-qPCR分析，發現來自病毒**細胞和病毒粒子的EV71 RNA都被拉下，而在體外轉錄的病毒基因組沒有被拉下。為了繪制EV71基因組中的ac4C修飾譜，作者進行了ac4C acRIP-seq分析。在EV71基因組的311到406核苷酸(nt)區域發現了一個明顯的ac4C峰，該峰位于5’ UTR區IRES內的莖環IV(nt 242-445)。EV71不編碼任何具有乙酰轉移酶活性的蛋白。為了研究EV71 RNA上的ac4C修飾是否被細胞乙酰轉移酶NAT10催化，作者進行了RIP-qPCR實驗，結果表明NAT10與EV71 RNA相互作用。此外，過表達或敲低NAT10時，病毒RNA上的ac4C的強度相應增加或降低。綜上所述，EV71 RNA上含有ac4C修飾，且由宿主乙酰轉移酶NAT10介導。EV71在細胞質中進行復制，而NAT10主要分布在細胞核中，而免疫熒光顯示，在EV71存在的情況下，NAT10同時定位于細胞核和細胞質，表明EV71**改變了NAT10的亞細胞定位。此外，在病毒**過程中檢測到較強的NAT10信號，提示EV71**可能增強了NAT10的表達。
為了研究ac4C是否影響EV71的復制，作者構建了NAT10敲低Vero細胞并**EV71，發現EV71滴度和RNA拷貝數均**降低，暗示NAT10促進了病毒的復制。NAT10作用于共識基序5’-CCG-3’，促進中心胞苷的乙?；?。作者為了評估EV71 5’ UTR上的ac4C峰中的兩個5’-CCG-3’基序是否被ac4C修飾，構建了EV71 cDNA全長克隆的突變體Mut-331、Mut-350、Mut-331-350以及對照Mut-383。acRIP-qPCR結果顯示，與WT EV71相比，ac4C突變病毒粒子和突變病毒**細胞的EV71 RNA中的ac4C豐度均**降低，表明這些C殘基在EV71基因組中發生乙?；?。且當ac4C位點發生突變時，子代病毒滴度和基因組RNA拷貝數均**下降，而在shRNA介導的NAT10敲除的細胞中，WT和突變病毒的子代病毒滴度沒有差異。這些結果支持了ac4C在EV71復制中起著重要作用。在EV71復制過程中存在正鏈和負鏈RNA，與負鏈RNA相比，下調NAT10更**地降低了病毒正鏈RNA的水平，表明NAT10主要影響病毒正鏈RNA。
03 ac4C修飾通過增強PCBP2與IRES的結合來促進RNA的翻譯
EV71 RNA的乙?；稽c位于IRES的莖環IV(nt242-445)，對病毒蛋白合成至關重要，因此，ac4C修飾可能影響EV71 RNA的翻譯效率。作者用蔗糖密度梯度離心和qRT-PCR檢測了在有無NAT10存在的情況下，核糖體對病毒RNA的裝載效率。值得注意的是，shRNA介導的NAT10敲除**抑制了EV71 RNA上的核糖體裝載，表明ac4C增強了EV71 RNA的翻譯。作者構建了插入EV71 WT或ac4C突變體的5’ UTR區的eGFP報告質粒，并將其轉染到RD細胞中，發現EV71 ac4C突變體轉染細胞中eGFP的表達減少，進一步表明ac4C提高了EV71 RNA的翻譯效率。體外翻譯實驗同樣證實了ac4C促進了EV71 RNA的翻譯。接下來，作者通過RIP-qPCR研究了EV71 WT或ac4C突變體IRES與PCBP2和HNRNPK的結合能力，結果表明，ac4C通過選擇性地增強PCBP2與IRES的結合來促進病毒的翻譯。
04 ac4C修飾提高了EV71 RNA的穩定性
mRNA的翻譯效率和穩定性有著錯綜復雜的聯系，mRNA翻譯的減少降低了mRNA的穩定性，反過來降低了翻譯效率。為了探討ac4C修飾是否與EV71 RNA的穩定性有關，作者構建了EV71 WT和ac4C突變體的3D移碼突變質粒，并將其轉染到Vero細胞中，在不同時間點進行qRT-PCR分析。結果顯示，與WT病毒相比，ac4C突變體的RNA降解速度加快。然而，當使用重構蛋白抑制NAT10的功能時，WT病毒和突變病毒之間的RNA降解率沒有**差異。以上結果表明，ac4C修飾影響了RNA的降解效率。值得注意的是，在ac4C修飾的情況下，WT-mut3D和Mut-331-350-mut3D的RNA穩定性都增加了，表明ac4C增強了EV71 RNA的穩定性。接下來，作者探討了病毒RNA翻譯對RNA穩定性的影響。當使用環己酰亞胺處理細胞抑制翻譯時，WT-3Dmut RNA的降解加速，而ac4C突變體RNA的降解速率沒有明顯變化。值得注意的是，PCBP2的敲除導致了病毒RNA的加速降解。這些結果表明，ac4C對EV71 RNA穩定性的影響與病毒RNA的翻譯效率有關。
為了研究乙?；欠裼绊懥瞬《镜闹虏⌒?，作者用EV71 WT或Mut-331-350**AG6干擾素受體缺陷小鼠。與**WT病毒的小鼠相比，**ac4C突變病毒的小鼠顯示出更長的存活時間和更慢的體重減輕，且在**WT病毒的小鼠中觀察到更嚴重的肢體癱瘓。此外，qRT-PCR分析顯示，**Mut-331-350病毒的小鼠，所有檢測**的肌肉、腸、腦、心、肝、肝、脾、肺和腎中的病毒RNA水平均**降低。在mut-331-350**小鼠的肢體肌肉、大腦和腸道中觀察到致病性降低，導致肌纖維壞死和神經元損傷減少，腸細胞增生、腸絨毛上皮細胞溶解、絨毛頂端細胞空泡化減少。綜上所述，這些結果表明EV71 ac4C突變減少了小鼠的病理損傷。
01 ac4C RNA修飾測序
ac4C RNA修飾測序
對ac4C RNA乙?；?，目前***的檢測手段為acRIP-seq技術，適用于ac4C RNA乙?；V研究，快速篩選ac4C RNA乙?；谢?。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的ac4C測序：
02 檢測整體ac4C RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
03 ac4C RNA修飾上游酶的篩選
ac4C RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控ac4C RNA乙?；募谆D移酶。
04 ac4C RNA修飾靶基因驗證
acRIP-qPCR
云序提供acRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證靶基因RNA修飾水平。
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
相關產品
m7G RNA甲基化測序
往期回顧
至此我司已經為合作客戶發在Nucleic Acids Research（IF=19.16）、Journal of Hematology & Oncology （IF=23.168）、Advanced Science雜志（IF=17.52）等核心期刊中均提供過ac4C acRIP-seq高通量技術服務以及生信分析。
影響因子：19.160
發表時間：2022年8月16日
研究方法：ac4C acRIP-seq、acRIP-qPCR、RIP-qPCR
文章鏈接：N4-acetylcytidine regulates the replication and pathogenicity of enterovirus 71
技術路線
研究內容
01 EV71 RNA的5’ UTR中含有ac4C修飾，且宿主NAT10表達模式發生改變
為了研究EV71 RNA是否含有ac4C修飾，作者大規模純化EV71 RNA，并通過UPLC-MS/MS進行定量，發現病毒粒子的EV71 RNA中ac4C殘基占總胞苷的0.201%。此外，針對EV71基因組RNA進行acRIP-qPCR分析，發現來自病毒**細胞和病毒粒子的EV71 RNA都被拉下，而在體外轉錄的病毒基因組沒有被拉下。為了繪制EV71基因組中的ac4C修飾譜，作者進行了ac4C acRIP-seq分析。在EV71基因組的311到406核苷酸(nt)區域發現了一個明顯的ac4C峰，該峰位于5’ UTR區IRES內的莖環IV(nt 242-445)。EV71不編碼任何具有乙酰轉移酶活性的蛋白。為了研究EV71 RNA上的ac4C修飾是否被細胞乙酰轉移酶NAT10催化，作者進行了RIP-qPCR實驗，結果表明NAT10與EV71 RNA相互作用。此外，過表達或敲低NAT10時，病毒RNA上的ac4C的強度相應增加或降低。綜上所述，EV71 RNA上含有ac4C修飾，且由宿主乙酰轉移酶NAT10介導。EV71在細胞質中進行復制，而NAT10主要分布在細胞核中，而免疫熒光顯示，在EV71存在的情況下，NAT10同時定位于細胞核和細胞質，表明EV71**改變了NAT10的亞細胞定位。此外，在病毒**過程中檢測到較強的NAT10信號，提示EV71**可能增強了NAT10的表達。
圖1. EV71含有ac4C修飾，并改變了NAT10的表達模式
為了研究ac4C是否影響EV71的復制，作者構建了NAT10敲低Vero細胞并**EV71，發現EV71滴度和RNA拷貝數均**降低，暗示NAT10促進了病毒的復制。NAT10作用于共識基序5’-CCG-3’，促進中心胞苷的乙?；?。作者為了評估EV71 5’ UTR上的ac4C峰中的兩個5’-CCG-3’基序是否被ac4C修飾，構建了EV71 cDNA全長克隆的突變體Mut-331、Mut-350、Mut-331-350以及對照Mut-383。acRIP-qPCR結果顯示，與WT EV71相比，ac4C突變病毒粒子和突變病毒**細胞的EV71 RNA中的ac4C豐度均**降低，表明這些C殘基在EV71基因組中發生乙?；?。且當ac4C位點發生突變時，子代病毒滴度和基因組RNA拷貝數均**下降，而在shRNA介導的NAT10敲除的細胞中，WT和突變病毒的子代病毒滴度沒有差異。這些結果支持了ac4C在EV71復制中起著重要作用。在EV71復制過程中存在正鏈和負鏈RNA，與負鏈RNA相比，下調NAT10更**地降低了病毒正鏈RNA的水平，表明NAT10主要影響病毒正鏈RNA。
圖2. ac4C修飾促進了EV71的復制
03 ac4C修飾通過增強PCBP2與IRES的結合來促進RNA的翻譯
EV71 RNA的乙?；稽c位于IRES的莖環IV(nt242-445)，對病毒蛋白合成至關重要，因此，ac4C修飾可能影響EV71 RNA的翻譯效率。作者用蔗糖密度梯度離心和qRT-PCR檢測了在有無NAT10存在的情況下，核糖體對病毒RNA的裝載效率。值得注意的是，shRNA介導的NAT10敲除**抑制了EV71 RNA上的核糖體裝載，表明ac4C增強了EV71 RNA的翻譯。作者構建了插入EV71 WT或ac4C突變體的5’ UTR區的eGFP報告質粒，并將其轉染到RD細胞中，發現EV71 ac4C突變體轉染細胞中eGFP的表達減少，進一步表明ac4C提高了EV71 RNA的翻譯效率。體外翻譯實驗同樣證實了ac4C促進了EV71 RNA的翻譯。接下來，作者通過RIP-qPCR研究了EV71 WT或ac4C突變體IRES與PCBP2和HNRNPK的結合能力，結果表明，ac4C通過選擇性地增強PCBP2與IRES的結合來促進病毒的翻譯。
圖3. ac4C提高了EV71 RNA的翻譯效率
04 ac4C修飾提高了EV71 RNA的穩定性
mRNA的翻譯效率和穩定性有著錯綜復雜的聯系，mRNA翻譯的減少降低了mRNA的穩定性，反過來降低了翻譯效率。為了探討ac4C修飾是否與EV71 RNA的穩定性有關，作者構建了EV71 WT和ac4C突變體的3D移碼突變質粒，并將其轉染到Vero細胞中，在不同時間點進行qRT-PCR分析。結果顯示，與WT病毒相比，ac4C突變體的RNA降解速度加快。然而，當使用重構蛋白抑制NAT10的功能時，WT病毒和突變病毒之間的RNA降解率沒有**差異。以上結果表明，ac4C修飾影響了RNA的降解效率。值得注意的是，在ac4C修飾的情況下，WT-mut3D和Mut-331-350-mut3D的RNA穩定性都增加了，表明ac4C增強了EV71 RNA的穩定性。接下來，作者探討了病毒RNA翻譯對RNA穩定性的影響。當使用環己酰亞胺處理細胞抑制翻譯時，WT-3Dmut RNA的降解加速，而ac4C突變體RNA的降解速率沒有明顯變化。值得注意的是，PCBP2的敲除導致了病毒RNA的加速降解。這些結果表明，ac4C對EV71 RNA穩定性的影響與病毒RNA的翻譯效率有關。
圖4. ac4C增強了EV71 RNA的穩定性
05 ac4C在體內和體外均促進了EV71 RNA與3D的結合
3D是在EV71復制過程中直接結合并合成病毒RNA的關鍵蛋白。由于乙?；龠M了PCBP2與EV71 RNA的結合，作者接下來評估了ac4C是否影響了3D與病毒RNA的結合。作者通過RIP-qPCR分析與3D結合的RNA，發現3D結合的EV71 RNA通過重構蛋白處理抑制NAT10而減少，表明ac4C修飾影響了病毒RNA與3D的結合。然而，當ac4C突變體病毒與重構蛋白一起培養時，3D結合的RNA并沒有明顯的變化。這些數據表明，ac4C修飾促進了EV71 RNA與3D的結合。為了探索ac4C修飾是否影響3D與病毒基因組的結合，作者進行了3D體外結合試驗實驗，結果不僅表明ac4C在體外增強了3D結合，而且表明乙?；稽c的位置對其結合能力具有重要作用。
圖5. ac4C促進了EV71 RNA與3D的結合
06 EV71 ac4C突變病毒在小鼠體內的致病性降低為了研究乙?；欠裼绊懥瞬《镜闹虏⌒?，作者用EV71 WT或Mut-331-350**AG6干擾素受體缺陷小鼠。與**WT病毒的小鼠相比，**ac4C突變病毒的小鼠顯示出更長的存活時間和更慢的體重減輕，且在**WT病毒的小鼠中觀察到更嚴重的肢體癱瘓。此外，qRT-PCR分析顯示，**Mut-331-350病毒的小鼠，所有檢測**的肌肉、腸、腦、心、肝、肝、脾、肺和腎中的病毒RNA水平均**降低。在mut-331-350**小鼠的肢體肌肉、大腦和腸道中觀察到致病性降低，導致肌纖維壞死和神經元損傷減少，腸細胞增生、腸絨毛上皮細胞溶解、絨毛頂端細胞空泡化減少。綜上所述，這些結果表明EV71 ac4C突變減少了小鼠的病理損傷。
圖6. ac4C突變病毒在小鼠中表現出致病性降低
小 結
本文運用ac4C acRIP-seq測序技術鑒定到腸道病毒EV71基因組的5’ UTR區IRES內存在ac4C修飾，且由宿主乙酰轉移酶NAT10催化產生。該ac4C修飾通過增強PCBP2與IRES的結合來增強病毒RNA的翻譯，并提高了RNA的穩定性。此外，抑制NAT10或突變ac4C位點抑制了EV71的復制，且ac4c缺陷突變體EV71在小鼠體內表現出致病性降低。該研究突出說明了ac4C在EV71**中的重要作用，并為潛在的抗病毒治療提供了新的方向。
云序生物ac4C修飾研究五大模塊
01 ac4C RNA修飾測序
ac4C RNA修飾測序
對ac4C RNA乙?；?，目前***的檢測手段為acRIP-seq技術，適用于ac4C RNA乙?；V研究，快速篩選ac4C RNA乙?；谢?。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的ac4C測序：
- ac4C 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
- ac4C LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
- ac4C Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
- ac4C mRNA測序
- ac4C rRNA測序
- ac4C circRNA測序
- ac4C tRNA測序
02 檢測整體ac4C RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
03 ac4C RNA修飾上游酶的篩選
ac4C RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控ac4C RNA乙?；募谆D移酶。
04 ac4C RNA修飾靶基因驗證
acRIP-qPCR
云序提供acRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證靶基因RNA修飾水平。
05 機制互作研究
RIP-seq/qPCR篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
-- 云序生物服務優勢 --
優勢一：云序累計支持客戶發表 84 +篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子 814 +,其中RNA乙?；瘻y序高達3篇論文IF接近20。
優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：**提供ac4C一站式服務：ac4C整體水平檢測、acRIP-seq、acRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull down等。
優勢五：率先研發超微量acRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內*全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
云序客戶多種RNA修飾（m6A以外修飾）部分文章列表
云序客戶m6A修飾部分文章列表
相關產品
往期回顧
瀏覽器自帶分享功能也很好用哦~相關新聞
關于我們
未來，公司將致力于高通量技術在疾病預測、診斷、個性化醫療等方面的應用和開發，致力于為國內外科研和醫療用戶提供先進的高通量檢測系統解決方案。
技術平臺
上海云序生物科技有限公司
關注我們
公眾號 官網QQ
版權所有 ? 上海云序生物科技有限公司
滬ICP備18035353號-1
選擇區號
瀏覽器自帶分享功能也很好用哦~
?
復制成功
×<optgroup id="cbifi"></optgroup>