N6-甲基腺苷(m6A)修飾是哺乳動物mRNA中*常見的化學修飾，通過調節多種細胞過程發揮重要作用。先前的研究報道，m6A與調節**的發生和發展有關。然而，在甲狀腺**狀*(PTC)中，m6A修飾和m6A去甲基化酶FTO對糖代謝的調節失調尚未完全闡明。2022年1月28日，云序客戶中國醫科大學附屬**醫院的研究者們在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research雜志上發表了文章“FTO suppresses glycolysis and growth of papillary thyroid cancer via decreasing stability of APOE mRNA in an N6- methyladenosine-dependent manner”。本文發現FTO通過IGF2BP2介導的m6A修飾抑制APOE的表達，且可能通過調節IL-6/JAK2/STAT3信號通路來抑制PTC的糖酵解代謝，從而抑制**生長。云序生物有幸參與了此項研究中的m6A MeRIP-seq、RNA-seq等高通量技術服務。


發表期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
影響因子：12.658
發表時間：2022年1月28日
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR
文章鏈接：FTO suppresses glycolysis and growth of papillary thyroid cancer via decreasing stability of APOE mRNA in an N6-methyladenosine-dependent manner

技術路線

01  PTC中m6A修飾異常，FTO表達下調
為了探索m6A修飾在PTC中的作用，作者首先利用TCGA和GEO等公共臨床數據庫，比較了m6A修飾相關酶在PTC組織和正常甲狀腺組織中的表達水平。TCGA數據集(圖1.A)和GEO數據集(圖1.B)分析顯示，與正常組織相比，PTC組織中去甲基化酶FTO的基因表達**下調。作者進而通過qRT-PCR檢測了30對(圖1.C)和100對(圖1.E)PTC組織樣本，結果同樣顯示，在PTC組織中FTO基因表達下調。且與去甲基化酶表達下調一致，PTC組織中m6A的總體水平高于配對非*組織(圖1.D)。免疫組化法(圖1.F)和免疫印跡分析(圖1.G)結果顯示，PTC組織中FTO蛋白表達下調。這些結果表明，FTO在PTC中基因及蛋白表達水平均**下調，并可能通過m6A修飾調控PTC的進展。

圖1. PTC中FTO表達下調，總m6A水平升高

02   FTO在體內、體外抑制PTC**生長
作者檢測了FTO在正常人甲狀腺濾泡上皮細胞系Nthy-ori3-1和4種PTC細胞系(K1、BC***、IHH4和TPC1)中的相對表達，結果顯示IHH4和BC***中FTO的表達量略低于Nthy-ori3-1細胞系(圖2.A)。因此，與PTC組織中FTO的表達趨勢一致的KI和TPC1細胞系被運用于后續研究。作者首先通過qRT-PCR和WB驗證了FTO敲低和FTO過表達的有效性(圖2.B-C)。進一步的研究結果顯示，FTO的敲低或過表達分別增加或降低了PTC細胞的整體m6A修飾水平(圖2.D)。而CCK-8檢測和集落形成檢測結果顯示，FTO敲低**促進了PTC細胞的增殖(圖2.E-F)。此外，研究表明，過表達FTO抑制了PTC細胞的增殖，而過表達FTO-mut (去甲基化結構域缺失)無細胞增殖(圖2.G-H)，暗示FTO誘導的PTC增殖依賴于其去甲基化酶的功能。進一步體內實驗結果顯示，在異種移植小鼠模型中，敲低或過表達FTO**增加或降低了**的生長和**重量(圖2.I-N)。然而，在過表達FTO-mut后，在體內未觀察到FTO對**生長的影響(圖2.L-N)，表明FTO通過其去甲基化結構域抑制PTC**生長。

圖2. FTO可抑制PTC細胞的體內外增殖

03   FTO通過調節糖酵解來抑制PTC的生長
FTO可以通過控制能量消耗來維持能量穩態。為了確定FTO對PTC糖酵解代謝的調控作用，作者通過ECAR代謝分析，發現FTO敲低**增加了K1和TPC1細胞中ECAR水平(圖3.A)，表明其可抑制PTC中的糖酵解。糖酵解產生大量的乳酸，并且糖酵解中間體可能被轉移到各種生物合成途徑中。體外實驗分析顯示，在FTO敲低后，PTC細胞的葡萄糖攝取和乳酸產量**增加(圖3.B-C)，而過表達FTO**降低了PTC細胞中的ECAR水平、葡萄糖攝取和乳酸生成(圖3.I-K)。作者進一步測定了FTO敲低后糖酵解中關鍵酶的表達水平，來分析糖酵解的調控機制。QRT-PCR(圖3.D)和免疫印跡法(圖3.E)結果顯示，在FTO敲低后，K1細胞中，GLUT1、HK-II和LDHA 基因和蛋白表達水平**上調，而過表達FTO后，GLUT1、HK-II和LDHA蛋白的表達**下調(圖3.L)。而用糖酵解抑制劑2-DG處理PTC細胞后，FTO敲低引起的細胞增殖和集落形成被抑制(圖3.F-G)。體內實驗結果也顯示，敲低或過表達FTO基因后，異種移植小鼠**模型中的葡萄糖攝取**增加或降低(圖3.H/M)。然而，過表達FTO-mut后，在體內和體外均未觀察到對糖酵解的影響(圖3.I-M)，表明FTO依賴其去甲基化結構域調節糖酵解。綜上所述，這些研究表明FTO通過調節糖酵解來抑制PTC的進展。

圖3. FTO通過調節糖酵解代謝抑制PTC生長

04  RNA-seq和MeRIP-seq確定APOE為FTO的靶基因
為了探索FTO在PTC中的下游潛在靶點，作者采用K1細胞進行RNA-seq檢測了si-NC組和si-FTO組的表達差異基因(DEGs)。結果顯示，FTO基因敲低后，有490個基因表達**下調，而有675個基因表達**上調(圖4.A)。為了驗證基因表達的變化是否與FTO介導的m6A修飾有關，作者采用m6A MeRIP-seq篩選在K1細胞中FTO敲低后**升高的m6A峰。m6A MeRIP-seq組在si-NC組有2553個獨特的m6A峰，在si-FTO組有1989個獨特的m6A峰，兩組有8496個共有的m6A峰(圖4.B)。分析顯示，在si-NC和si-FTO組中，m6A峰在終止密碼子附近高度富集(圖4.C)。對K1細胞中m6A甲基化組的分析顯示，*常見的m6 A基序“GGACU”在m6A峰中高度富集(圖4.D)。接下來，作者篩選了7個m6A甲基化水平及基因表達水平均上調的基因，進行進一步的功能實驗，其中APOE可能是FTO介導的m6 A修飾的關鍵基因，因為它可以調節PTC的糖酵解代謝(圖4.E)。對m6A MeRIP-seq結果進行IGV可視化，顯示APOE mRNA在終止密碼子附近有一個在FTO敲除后**升高的m6A峰(圖4.F)。然而，APOE在PTC中的表達和生物學功能有待進一步闡明。因此，作者選擇APOE作為FTO介導的m6A修飾的靶基因進行后續分析。

圖4-1. RNA-seq和MeRIP-seq確定APOE為FTO的靶基因

05   FTO通過IGF2BP2介導的m6A修飾調節APOE mRNA的穩定性
與m6A MeRIP-seq分析結果一致，FTO的敲低或過表達上調或下調了APOE的基因及蛋白表達水平(圖5.G-J)，且過表達FTO-mut后，APOE的表達沒有發生變化(圖5.H-J)。為了探索FTO對APOE的m6A修飾，作者使用了一種甲基化抑制劑DAA處理，結果顯示DAA**降低了FTO敲低所上調的APOE的表達(圖5.K)。接下來，作者采用MeRIP-qPCR方法驗證來m6A MeRIP-seq數據，結果顯示，在FTO敲低后，APOE mRNA的m6A水平**升高(圖5.I-M)。隨后，作者構建了包含野生型或突變型APOE的熒光素酶報告基因，以探索m6A修飾對APOE表達的影響。結果顯示，敲低或過表達FTO**增加或降低了野生型APOE的熒光素酶活性，而對突變型APOE的熒光素酶活性沒有明顯的影響(圖5.N-O)。這些結果表明，FTO在APOE的m6A修飾中起著一定的作用。

此外，APOE的表達隨著m6A修飾水平的增加而**增加，提示其m6A修飾可能增加了APOE mRNA的穩定性。與預期結果一致，RNA穩定性曲線顯示，在K1和TPC1細胞中，FTO敲低后，APOE mRNA的半衰期**延長(圖5.P)。因此，FTO誘導的APOE表達上調可歸因于m6A修飾導致的APOE mRNA穩定性的增加。作為m6A readers，IGF2BP1-3可調節mRNA的穩定性，進一步分析顯示，敲低IGF2BP2，而不是IGF2BP1/3，**下調了K1和TPC1細胞中的APOE mRNA(圖5.Q)。此外，在K1和TPC1細胞中，IGF2BP2基因敲低后，APOE mRNA的半衰期**降低(圖5.R)。針對IGF2BP2的RIP-qPCR結果表明，IGF2BP2直接與APOE的m6A位點結合(圖5.S)，而FTO的下調**增加了IGF2BP2與APOE mRNA的結合能力(圖5.T)。綜上所述，這些結果表明，FTO通過IGF2BP2介導的m6A修飾來抑制APOE mRNA的穩定性和表達。

圖5. FTO通過IGF2BP2介導的m6A修飾調節APOE mRNA的穩定性

06  APOE通過調節糖酵解來調節PTC的增殖
雖然FTO通過調節糖酵解在PTC生長中發揮重要作用，但尚不清楚該作用是否歸因于其下游靶基因APOE。作者通過qRT-PCR檢測發現PTC組織中APOE的mRNA表達相對于成對非*組織**上調(圖6.A)，且與FTO的表達水平呈**負相關(圖6.B)。與此結果一致，FTO和APOE在TCGA數據庫中的表達也呈明顯的負相關(R=-0.259，p=2.96e-09)(圖6.C)。此外，PTC組織中APOE蛋白的表達明顯高于鄰近非*組織(圖6.D)。為了探究APOE在PTC中的作用，作者發現敲低APOE**降低了si-FTO誘導的高細胞增殖水平(圖6.E-F)，高ECAR水平(圖6.G)以及葡萄糖攝取和乳酸生成的增加(圖6.H-I)，這表明APOE可以逆轉FTO引起的糖酵解速率的增加。對關鍵糖酵解蛋白表達分析顯示，APOE敲低后，只有GLUT1蛋白的表達**下調，而HK-II和LDHA的表達水平未被影響(圖6.J)，表明FTO和APOE主要通過調節葡萄糖轉運來影響糖酵解。與FTO相似，2-DG抑制了過表達APOE引起的增殖增加(圖6.K)，表明APOE通過糖酵解影響細胞增殖。體內分析顯示，在由sh-FTO引起的異種移植小鼠模型中，sh-APOE**降低了**生長(圖6.L-M)，**重量(圖6.N)以及葡萄糖攝取(圖6.O)。這些結果表明，APOE可以通過糖酵解促進**生長，并在PTC中受到FTO介導的m6A修飾的調控。

圖6. APOE與FTO呈負相關，并通過調節糖酵解來調節PTC的增殖

07  FTO和APOE可能通過IL6/JAK2/STAT3信號通路調控PTC的糖酵解
為了探索FTO/APOE軸下游的相關信號通路，作者采用基因**富集分析(GSEA)來鑒定PTC中FTO和APOE的富集特征，發現，FTO/APOE下游的共同信號通路只有IL-6/JAK/STAT3信號通路?；?a href="http://www.cccppp1.com/product-item-2.html" data-linktype="2" style="white-space:normal;margin:0px;padding:0px;outline:0px;color:#0052FF;-webkit-tap-highlight-color:rgba(0, 0, 0, 0);cursor:pointer;max-width:100%;font-size:14px;letter-spacing:0.544px;text-align:justify;background-color:#FFFFFF;font-family:微軟雅黑;box-sizing:border-box !important;overflow-wrap:break-word !important;">RNA-seq數據的GSEA結果顯示，與si-NC組相比，si-FTO組中IL-6/JAK/STAT3信號通路高度富集(圖7.A)。此外，基于TCGA數據庫的GSEA結果顯示，APOE高表達組與低表達組相比，IIL-6/JAK/STAT3信號通路高度富集(圖7.B)。這些GSEA研究結果表明，FTO和APOE可能通過調節IL6/JAK/STAT3信號通路來影響PTC的糖酵解。隨后，作者通過WB實驗發現FTO敲低后，該通路中磷酸化的JAK2(pJAK2)和STAT3(pSTAT3)的蛋白表達水平**升高，而過表達FTO則相反(圖7.C-D)。此外，在APOE敲低后，這兩種磷酸化蛋白的蛋白表達水平**降低，而過表達APOE的作用則相反(圖7.E-F)，且APOE敲低**消除了si-FTO引起的pJAK2、pSTAT3和GLUT1蛋白表達水平的升高(圖7.G)。綜上所述，APOE在PTC中，通過FTO修飾m6A后調節IL6/JAK2/STAT3信號通路，對糖酵解發揮作用。

圖7. FTO和APOE通過調節IL-6/JAK2/STAT3信號通路來調控PTC的糖酵解

本文通過一系列體內外功能實驗發現去甲基化酶FTO抑制了PTC的糖酵解和生長，并通過RNA-seq、m6A MeRIP-seq聯合分析鑒定得到了FTO下游靶基因APOE。作者通過對APOE的進一步機制及功能研究，發現FTO通過IGF2BP2介導的m6A修飾抑制APOE的表達，且可能通過調節IL-6/JAK2/STAT3信號通路來抑制PTC的糖酵解代謝，從而抑制**生長。該文章為從甲基化修飾酶出發的m6A機制研究提供了一個**的參考范本。文中機制研究涉及到的整體甲基化水平檢測，RNA修飾相關酶篩選，RNA-seq&m6A MeRIP-seq，以及后續MeRIP-qPCR驗證，RIP-qPCR機制互作研究等，云序生物均可為您提供一站式服務。

01 m6A RNA修飾測序

m6A RNA修飾測序（m6A-meRIP-seq）

對m6A RNA甲基化，目前*流行的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

• m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）

• m6A  LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）

• m6A  Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）

• m6A  mRNA測序

• m6A  miRNA測序

02 檢測整體m6A RNA修飾水平

LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平

**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。

比色法檢測整體RNA修飾水平

快速檢測m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選

m6A RNA修飾相關酶PCR芯片

尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗證

MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP試劑盒

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05 機制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP試劑盒

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5.3 雙熒光素酶實驗

驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。

5.4 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

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