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客戶文章|m6A甲基化測序助力膿毒癥誘導的ARDS表位機制研究
m6A修飾在膿毒癥誘導的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)中的具體作用尚不清楚。2022年5月25日，云序客戶上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院俞衛鋒課題組在Front Immunol雜志上發表文章
“METTL3-Mediated N6-Methyladenosine Modifification of Trim59 mRNA Protects Against Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome”該文章發現METTL3是參與m6A RNA修飾缺失的主要調控因子，能通過trim59相關的NF-kB失活抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷
“METTL3-Mediated N6-Methyladenosine Modifification of Trim59 mRNA Protects Against Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome”該文章發現METTL3是參與m6A RNA修飾缺失的主要調控因子，能通過trim59相關的NF-kB失活抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷
m6A修飾在膿毒癥誘導的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)中的具體作用尚不清楚。2022年5月25日，云序客戶上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院俞衛鋒課題組在Front Immunol雜志上發表文章“METTL3-Mediated N6-Methyladenosine Modifification of Trim59 mRNA Protects Against Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome”該文章發現METTL3是參與m6A RNA修飾缺失的主要調控因子，能通過trim59相關的NF-kB失活抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷。云序生物有幸參與了此項研究中的m6A MeRIP-seq、RNA-seq等高通量技術服務。
發表期刊：Front Immunol
發表日期：2022年5月25日
影響因子：8.786
研究方法：RNA-seq、m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、ELISA比色法
樣品類型：細胞
文章鏈接：METTL3-Mediated N6-Methyladenosine Modification of Trim59 mRNA Protects Against Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome
01 膿毒癥誘導的ARDS中m6A修飾的失調
為了闡明m6A修飾在隔膜誘導的ARDS中的功能作用，文章首先通過ELISA比色法評估了健康小鼠肺組織和膿毒癥小鼠肺組織中的RNA m6A整體水平，發現膿毒癥肺中總RNA中的m6A水平**降低（圖1. A）。比較肺組織和肺微血管內皮細胞（PMVECs）中writers(METTL3、METTL8、METTL14和WTAP)和erasers(ALKBH5和FTO)的mRNA m6A水平，發現甲基轉移酶METTL3和METTL14在膿毒癥肺和LPS刺激的PMVECs中**下調，其他基因的表達無**差異（圖1. B-C）。通過免疫印跡法檢測，METTL3在膿毒性肺組織和LPS處理的PMVECs中的蛋白表達也**低于正常肺組織（圖1. D-E）。免疫組織化學法結果表明，與正常肺組織相比，膿毒癥肺組織中METTL3的表達明顯降低（圖1. F）。表明膿毒癥的發生可能與m6A甲基轉移酶METTL3的失調有關。
02 METTL3與膿毒癥誘導ARDS中異常m6A修飾相關
為了確定METTL3在膿毒癥誘導的ARDS中的作用，文章構建了METTL3敲低模型，研究了METTL3對膿毒癥誘導的肺損傷的影響。假手術組小鼠的組織學檢查顯示肺正常，肺泡壁薄，偶有肺泡巨噬細胞，中性粒細胞少。METTL3 siRNA-CLP中的小鼠與NC siRNA-CLP組相比，該組的中性粒細胞浸潤、出血、透明膜形成和肺泡壁增厚明顯增加（圖2. A），結果與肺損傷評分結果一致，并表明METTL3缺失**加重了膿毒癥誘導的肺損傷（圖2. B）。與NC siRNA相比，METTL3 siRNA**后支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的細胞計數、蛋白和促炎細胞因子表達水平**升高（圖2. C-D）。文章還檢測了MPO的活性來評估肺組織中中性粒細胞的積累，METTL3下調**提高了膿毒癥小鼠的MPO活性(圖2. E)。通過Evans blue組織分散度評估，METTL3基因敲除的小鼠顯示血管滲漏增加(圖2. F)，此外，對循環血液中測量了一組炎癥標志物，結果表明，在檢測的40種炎癥標志物中，有12種比NC siRNA-CLP組中增加了至少2倍(圖2. G)。siMETTL3處理導致CLP誘導的動物死亡**增加，小鼠在72小時后沒有存活(圖2. H)。這些數據表明，METTL3的敲低加重了內皮屏障完整性的損傷和膿毒癥引起的炎癥反應。
03 METTL3在體外調節血管內皮屏障功能
由于METTL3在膿毒癥肺中的表達**下調，文章進一步研究了METTL3在內皮屏障維持中的關鍵作用。在不同的時間點用LPS刺激細胞。測量經上皮電阻(TEER)來評估屏障功能。METTL3的下調在6h時導致了單層抗性的**降低，并持續了至少24h(圖3. A)，表明METTL3的下調**增加了HULEC-5a細胞的通透性。此外，文章還發現用METTL3 shRNA處理HULEC-5a細胞時，血管鈣粘蛋白發生連接丟失和細胞間黏附分子-1積累(圖3. C)，表明抑制METTL3會破壞內皮細胞通透性，加重內皮屏障功能障礙。與shRNA對照組相比，METTL3下調導致的炎癥因子表達升高（圖3. E）。而METTL3過表達能**改善內皮細胞的單層抗性(圖3. B)，并提高了ve-鈣粘蛋白連接的表達（圖3. D），炎癥反應被有效抑制（圖3. F）。結果表明，METTL3在血管間隔誘導的肺損傷中調節血管內皮屏障功能中起著關鍵作用。
04 METTL3介導的m6A的Trim59 mRNA修飾維持其YTHDF1依賴的穩定性
為了確定METTL3調控內皮屏障功能的分子機制，文章對兩組HULEC-5a細胞進行了RNA-seq和m6A MeRIP-seq檢測。m6A MeRIP-seq結果顯示，1011個轉錄本中的m6A峰豐度下降（圖4. A）。通過RNA-seq、m6A MeRIP-seq結果和GO分析，文章選擇了5個與免疫應答調節和細胞粘附相關的5個基因(Tanc2、Trim59、Dhx33、Map3k13和Map3k20)，驗證了在METTL3敲低的HULEC-5a細胞中這5個候選基因的mRNA水平。在HULEC-5a細胞中，只有Trim59被METTL3持續下調。m6A測序在對照組和m6A敲低組中分別鑒定出32757和33227個m6A峰（圖4. B）。當m6A甲基化組被定位時，確定了m6A共有基序GGAC(圖4. C)。與對照組相比，經shMETTL3處理的HULEC-5a細胞中，Trim59mRNA外顯子周圍的m6A峰的大小**減小(圖4. D)。m6A MeRIP-seq驗證結果表明，與shRNA對照組相比，m6A特異性抗體**降低了METTL3敲低誘導的Trim59mRNA的富集(圖4. E)。并且敲除METTL3基因可以縮短Trim59的半衰期(圖4. F)。RIP結果發現，YTHDF1在Trim59mRNA中明顯富集于YTHDF2，而不是YTHDF2和YTHDF3，這表明YTHDF1與Trim59mRNA之間存在相互作用(圖4. G)。YTHDF1沉默降低了LPS誘導的HULEC-5a細胞中Trim59的表達(圖4. H)。METTL3介導的m6A修飾通過YTHDF1依賴的Trim59mRNA的穩定性維持了Trim59的表達。
05 METTL3通過靶向Trim59調節內皮功能
為了進一步確定METTL3是否通過靶向Trim59調控內皮功能，文章將Trim59 siRNA共轉染到過表達METTL3的HULEC-5a細胞中（圖5. A-B）。經內皮電阻(TEER)結果顯示，在METTL3過表達的細胞中，敲除Trim59，部分逆轉了METTL3對脂多糖誘導的內皮損傷的保護作用（圖5. C）。當Trim59表達下調時，METTL3過表達介導的內皮屏障恢復被**抑制（圖5. D）。此外，Trim59的敲除加劇了內皮細胞的炎癥反應(圖5. E)。表明METTL3通過部分調節Trim59的表達來改善LPS誘導的血管內皮損傷。
06 METTL3通過Trim59相關的NF-kB失活抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷
為了確定METTL3介導的內皮損傷抑制是否參與了Trim59的調控，文章評估了METTL3對NF-kB通路因子表達的影響。METTL3過表達通過降低p65磷酸化**抑制NF-kB通路(圖6. A)，特異性NF-kB信號抑制劑BAY抑制p65磷酸化則降低METTL3誘導的內皮損傷標志物的表達(圖6. B)。Trim59的下調**促進了NF-kB通路的**(圖6. C)。這些數據表明，METTL3通過trim59相關的NF-kB失活調節膿毒癥誘導的ARDS的內皮功能。
該篇文章通過RNA-seq和 m6A MeRIP-seq分析發現，Trim59是TRIM家族的一個成員，是HULEC-5a細胞中METTL3敲除時被抑制的基因。文章發現METTL3介導的m6 A修飾在膿毒癥肺中被調節異常，證實了m6A修飾在膿毒癥誘導的ARDS中的一種新功能。研究還顯示了METTL3在調節血管內皮屏障功能中的關鍵作用。此外，在機制上，METTL3通過trim59相關的NF-kB失活來抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷。該文章為膿毒癥相關ARDS的新**策略的發展提供了見解，并揭示了這種修飾在膿毒癥相關肺損傷的診斷、預后和分子靶向**中的應用價值。
優勢一：云序累計支持客戶發表 83 +篇RNA修飾SCI論文，合計影響因子 795 + 優勢二：累計完成數千例 RNA甲基化測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。 優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。 優勢四：**提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序
發表期刊：Front Immunol
發表日期：2022年5月25日
影響因子：8.786
研究方法：RNA-seq、m6A MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、ELISA比色法
樣品類型：細胞
文章鏈接：METTL3-Mediated N6-Methyladenosine Modification of Trim59 mRNA Protects Against Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome
技術路線
研究內容
01 膿毒癥誘導的ARDS中m6A修飾的失調
為了闡明m6A修飾在隔膜誘導的ARDS中的功能作用，文章首先通過ELISA比色法評估了健康小鼠肺組織和膿毒癥小鼠肺組織中的RNA m6A整體水平，發現膿毒癥肺中總RNA中的m6A水平**降低（圖1. A）。比較肺組織和肺微血管內皮細胞（PMVECs）中writers(METTL3、METTL8、METTL14和WTAP)和erasers(ALKBH5和FTO)的mRNA m6A水平，發現甲基轉移酶METTL3和METTL14在膿毒癥肺和LPS刺激的PMVECs中**下調，其他基因的表達無**差異（圖1. B-C）。通過免疫印跡法檢測，METTL3在膿毒性肺組織和LPS處理的PMVECs中的蛋白表達也**低于正常肺組織（圖1. D-E）。免疫組織化學法結果表明，與正常肺組織相比，膿毒癥肺組織中METTL3的表達明顯降低（圖1. F）。表明膿毒癥的發生可能與m6A甲基轉移酶METTL3的失調有關。
圖1 膿毒癥誘導的ARDS中METTL3-m6A通路下調
02 METTL3與膿毒癥誘導ARDS中異常m6A修飾相關
為了確定METTL3在膿毒癥誘導的ARDS中的作用，文章構建了METTL3敲低模型，研究了METTL3對膿毒癥誘導的肺損傷的影響。假手術組小鼠的組織學檢查顯示肺正常，肺泡壁薄，偶有肺泡巨噬細胞，中性粒細胞少。METTL3 siRNA-CLP中的小鼠與NC siRNA-CLP組相比，該組的中性粒細胞浸潤、出血、透明膜形成和肺泡壁增厚明顯增加（圖2. A），結果與肺損傷評分結果一致，并表明METTL3缺失**加重了膿毒癥誘導的肺損傷（圖2. B）。與NC siRNA相比，METTL3 siRNA**后支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的細胞計數、蛋白和促炎細胞因子表達水平**升高（圖2. C-D）。文章還檢測了MPO的活性來評估肺組織中中性粒細胞的積累，METTL3下調**提高了膿毒癥小鼠的MPO活性(圖2. E)。通過Evans blue組織分散度評估，METTL3基因敲除的小鼠顯示血管滲漏增加(圖2. F)，此外，對循環血液中測量了一組炎癥標志物，結果表明，在檢測的40種炎癥標志物中，有12種比NC siRNA-CLP組中增加了至少2倍(圖2. G)。siMETTL3處理導致CLP誘導的動物死亡**增加，小鼠在72小時后沒有存活(圖2. H)。這些數據表明，METTL3的敲低加重了內皮屏障完整性的損傷和膿毒癥引起的炎癥反應。
圖2 METTL3缺失加重了CLP模型中的肺內皮損傷
03 METTL3在體外調節血管內皮屏障功能
由于METTL3在膿毒癥肺中的表達**下調，文章進一步研究了METTL3在內皮屏障維持中的關鍵作用。在不同的時間點用LPS刺激細胞。測量經上皮電阻(TEER)來評估屏障功能。METTL3的下調在6h時導致了單層抗性的**降低，并持續了至少24h(圖3. A)，表明METTL3的下調**增加了HULEC-5a細胞的通透性。此外，文章還發現用METTL3 shRNA處理HULEC-5a細胞時，血管鈣粘蛋白發生連接丟失和細胞間黏附分子-1積累(圖3. C)，表明抑制METTL3會破壞內皮細胞通透性，加重內皮屏障功能障礙。與shRNA對照組相比，METTL3下調導致的炎癥因子表達升高（圖3. E）。而METTL3過表達能**改善內皮細胞的單層抗性(圖3. B)，并提高了ve-鈣粘蛋白連接的表達（圖3. D），炎癥反應被有效抑制（圖3. F）。結果表明，METTL3在血管間隔誘導的肺損傷中調節血管內皮屏障功能中起著關鍵作用。
圖3 METTL3在體外調節血管內皮屏障功能
04 METTL3介導的m6A的Trim59 mRNA修飾維持其YTHDF1依賴的穩定性
為了確定METTL3調控內皮屏障功能的分子機制，文章對兩組HULEC-5a細胞進行了RNA-seq和m6A MeRIP-seq檢測。m6A MeRIP-seq結果顯示，1011個轉錄本中的m6A峰豐度下降（圖4. A）。通過RNA-seq、m6A MeRIP-seq結果和GO分析，文章選擇了5個與免疫應答調節和細胞粘附相關的5個基因(Tanc2、Trim59、Dhx33、Map3k13和Map3k20)，驗證了在METTL3敲低的HULEC-5a細胞中這5個候選基因的mRNA水平。在HULEC-5a細胞中，只有Trim59被METTL3持續下調。m6A測序在對照組和m6A敲低組中分別鑒定出32757和33227個m6A峰（圖4. B）。當m6A甲基化組被定位時，確定了m6A共有基序GGAC(圖4. C)。與對照組相比，經shMETTL3處理的HULEC-5a細胞中，Trim59mRNA外顯子周圍的m6A峰的大小**減小(圖4. D)。m6A MeRIP-seq驗證結果表明，與shRNA對照組相比，m6A特異性抗體**降低了METTL3敲低誘導的Trim59mRNA的富集(圖4. E)。并且敲除METTL3基因可以縮短Trim59的半衰期(圖4. F)。RIP結果發現，YTHDF1在Trim59mRNA中明顯富集于YTHDF2，而不是YTHDF2和YTHDF3，這表明YTHDF1與Trim59mRNA之間存在相互作用(圖4. G)。YTHDF1沉默降低了LPS誘導的HULEC-5a細胞中Trim59的表達(圖4. H)。METTL3介導的m6A修飾通過YTHDF1依賴的Trim59mRNA的穩定性維持了Trim59的表達。
圖4 METTL3介導的Trim59mRNA的m6A修飾維持了其YTHDF1依賴的穩定性
05 METTL3通過靶向Trim59調節內皮功能
為了進一步確定METTL3是否通過靶向Trim59調控內皮功能，文章將Trim59 siRNA共轉染到過表達METTL3的HULEC-5a細胞中（圖5. A-B）。經內皮電阻(TEER)結果顯示，在METTL3過表達的細胞中，敲除Trim59，部分逆轉了METTL3對脂多糖誘導的內皮損傷的保護作用（圖5. C）。當Trim59表達下調時，METTL3過表達介導的內皮屏障恢復被**抑制（圖5. D）。此外，Trim59的敲除加劇了內皮細胞的炎癥反應(圖5. E)。表明METTL3通過部分調節Trim59的表達來改善LPS誘導的血管內皮損傷。
圖5 METTL3通過靶向Trim59調節內皮功能
06 METTL3通過Trim59相關的NF-kB失活抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷
為了確定METTL3介導的內皮損傷抑制是否參與了Trim59的調控，文章評估了METTL3對NF-kB通路因子表達的影響。METTL3過表達通過降低p65磷酸化**抑制NF-kB通路(圖6. A)，特異性NF-kB信號抑制劑BAY抑制p65磷酸化則降低METTL3誘導的內皮損傷標志物的表達(圖6. B)。Trim59的下調**促進了NF-kB通路的**(圖6. C)。這些數據表明，METTL3通過trim59相關的NF-kB失活調節膿毒癥誘導的ARDS的內皮功能。
圖6 METTL3通過trim59相關的NF-kB失活抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷
總 結
該篇文章通過RNA-seq和 m6A MeRIP-seq分析發現，Trim59是TRIM家族的一個成員，是HULEC-5a細胞中METTL3敲除時被抑制的基因。文章發現METTL3介導的m6 A修飾在膿毒癥肺中被調節異常，證實了m6A修飾在膿毒癥誘導的ARDS中的一種新功能。研究還顯示了METTL3在調節血管內皮屏障功能中的關鍵作用。此外，在機制上，METTL3通過trim59相關的NF-kB失活來抑制膿毒癥誘導的ARDS的內皮損傷。該文章為膿毒癥相關ARDS的新**策略的發展提供了見解，并揭示了這種修飾在膿毒癥相關肺損傷的診斷、預后和分子靶向**中的應用價值。
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-MeRIP-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
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m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA） -
m6A LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA） -
m6A Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA） -
m6A mRNA測序 -
m6A miRNA測序
02 檢測整體m6A RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP試劑盒
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務以及銷售GenSeq® MeRIP試劑盒，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05 機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP試劑盒
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
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