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叒一篇，9分！云序eccDNA測序助力，湘雅發表國內**下咽鱗*環狀DNA成果
2021年11月，云序客戶發表國內**影響因子高達 15 分的 eccDNA 研究論文（Focal amplifications are associated with chromothripsis events and diverse prognoses in gastric cardia adenocarcinoma）；進入 2022年，云序生物的客戶又在 Nature 子刊 Cell Death and Disease（IF=9.685）上發表了一篇 eccDNA 研究文章，揭示了 eccDNA 上的 RAB3B 基因通過誘導細胞自噬而賦予下咽鱗*細胞順鉑抗藥性的原理。
染色體外環狀 DNA（Exochromosomal circular DNA，簡稱 eccDNA）是**存在于真核細胞中的一類特殊的環狀 DNA，近年有越來越多的研究發現 eccDNA 與各類*癥之間的關系。2021年9月，云序客戶發表論文揭示食管鱗*中的 eccDNA 譜學特征（Extrachromosomal circular DNAs are common and functional in esophageal squamous cell carcinoma）；2021年11月，云序客戶發表國內**影響因子高達 15 分的 eccDNA 研究論文（Focal amplifications are associated with chromothripsis events and diverse prognoses in gastric cardia adenocarcinoma）；進入 2022年，云序生物的客戶又在 Nature 子刊 Cell Death and Disease（IF=9.685）上發表了一篇 eccDNA 研究文章，揭示了 eccDNA 上的 RAB3B 基因通過誘導細胞自噬而賦予下咽鱗*細胞順鉑抗藥性的原理。
論文標題：Encodinggene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA andcontributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinomavia inducing autophagy
發表雜志：Cell Death and Disease（IF=9.685）
作者院校：中南大學湘雅三醫院
實驗方法：環狀DNA circle-seq、全轉錄組測序、環狀 DNA Sanger 測序、環狀 DNA qPCR 驗證(均由云序生物提供服務)
下咽鱗*（Hypopharyngeal squamous cell carcinoma ，簡稱HSCC）是頭頸鱗*（ Head and neck squamous cell carcinoma，簡稱HNSCC）的一種，這種疾病預后差，而發病率卻在快速上升。順鉑（Cis-Diamino-Dichloro-Platin，簡稱 Cisplatin 或 DDP）是一種常用于**下咽鱗*的化療藥物，但細胞自噬卻會賦予**順鉑抗藥性，對下咽鱗*的**帶來不利影響。本文作者使用了下咽鱗*細胞系FaDu 和具有順鉑抗藥性的下咽鱗*細胞系FaDu/DDP 作為實驗對象，進行了環狀 DNA 的circle-seq以及全轉錄組測序，并通過 Sanger 測序和 qPCR 驗證了 RAB3B 基因所在的環狀 DNA 的真實存在，發現 eccDNA 上的 RAB3B 基因可通過誘導細胞自噬而賦予下咽鱗*細胞順鉑抗性。下面我們就來了解一下本文的具體研究思路：
在FaDu 細胞和具有抗藥性的FaDu/DDP 細胞之間，找出了 1163 個 eccDNA 上的 2307 個差異表達的 eccDNA（Differentially Expressed EccDNAs，簡稱 DEEDs）。根據這些 DEEDs 進行的 KEGG pathway 和 GO 生物信息學分析顯示，多個與抗藥性相關的 KEGG 通路中存在**上調或下調的 DEEDs 上的基因，多個與細胞抗藥性相關的 GO 條目也富集有 DEEDs 上的基因，提示FaDu 細胞和 FaDu/DDP 細胞之間的 eccDNA 基因表達差異可能是導致其抗藥性差異的原因。
其**找到了 7 個 eccDNA 上的 24 個序列完整的基因，它們的 mRNA 和 eccDNA 表達量都在抗藥細胞系中**上調；10 個 eccDNA 上的 11 個序列完整的基因，它們的 mRNA 和 eccDNA 表達量都在抗藥細胞系中**下調。
RAB3B 屬于小G蛋白 RAB 家族，參與了細胞自噬和抗藥性的生物過程，作為一個*基因在多種*癥中被發現報道，但先前并無科學家證明過 RAB3B 在 HSCC 中的致病作用。
本篇論文的研究者用 qPCR 以及 Western Blot 的方法在 FaDu 和 FaDu/DDP 細胞中檢測了 RAB3B 的 mRNA 和蛋白表達水平，發現其在抗藥性細胞FaDu/DDP 當中的表達**上調。通過 shRNA 敲降和質粒過表達來降低或升高FaDu/DDP 細胞中的 RAB3B 的表達水平，研究者發現敲降 RAB3B 將會降低細胞對 DDP 的抗藥性（IC50 降低），而過表達 RAB3B 則會升高細胞對 DDP 的抗藥性（IC50升高）。同時，對細胞自噬標志物 LC3-I 和細胞自噬特異性底物 p62 的 Western Blot 檢測結果顯示，細胞自噬標志物 LC3-I 到 LC3-II 的轉化在 RAB3B 表達時上調，而自噬特異性底物 p62 則在 RAB3B 表達時下調，說明 RAB3B 可以促進細胞自噬的發生。電鏡觀察顯示，RAB3B 敲降細胞中的自噬囊泡**減少，也說明 RAB3B 可以促進細胞自噬的發生。研究者還構建了下咽鱗*的**類**（ Patient-derived tumor organoid，簡稱 PDO），結果發現順鉑藥物處理加上 RAB3B 敲降可對下咽鱗* PDO 造成****的打擊。
綜上可以得出結論，在體外環境下，RAB3B 可以誘導細胞自噬，進而產生順鉑抗藥性。
1.組織細胞環狀DNA測序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號，高效地純化和富集環狀DNA，再利用NGS測序和生信分析識別環狀DNA。結合優化的實驗流程，本環狀DNA測序服務具有檢出率高﹑準確性好等優點。
2.血清血漿環狀DNA測序
針對血清血漿微量樣品，云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開eccDNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高，損耗低，實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量，使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。
技術優勢：
技術優勢：
針對測序項目中篩選出的環狀DNA，云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。其主要目的在于：為用戶提供一種低成本的擴大樣品量驗證手段，節約實驗成本。通過設計反向引物進行PCR擴增，將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序，驗證連接位點處序列。
5.A&A Biotechnology 環狀 DNA 純化柱
A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分環狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內的**總代理。
優勢一：國內**提供環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序的公司，至今已經發表3篇高質量環狀DNA測序SCI論文。
優勢二：環狀DNA相關服務產品線*全的公司。
優勢三： A&A Biotechnology 總代理，采用原裝A&A Bio純化柱，環狀DNA 純化效果好。
優勢四：一站式服務：您只需按照送樣要求向云序生物寄送樣品，我們就能為您完成從環狀DNA 提取，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。
優勢五：嚴格質控流程：云序生物質控流程嚴格，層層把關，為客戶提供高準確度的結果。
優勢六：專業化生物信息分析：云序生物強大生物信息團隊，滿足客戶個性化數據分析要求。
往期 eccDNA 主題回顧
論文標題：Encodinggene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA andcontributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinomavia inducing autophagy
發表雜志：Cell Death and Disease（IF=9.685）
作者院校：中南大學湘雅三醫院
實驗方法：環狀DNA circle-seq、全轉錄組測序、環狀 DNA Sanger 測序、環狀 DNA qPCR 驗證(均由云序生物提供服務)
下咽鱗*（Hypopharyngeal squamous cell carcinoma ，簡稱HSCC）是頭頸鱗*（ Head and neck squamous cell carcinoma，簡稱HNSCC）的一種，這種疾病預后差，而發病率卻在快速上升。順鉑（Cis-Diamino-Dichloro-Platin，簡稱 Cisplatin 或 DDP）是一種常用于**下咽鱗*的化療藥物，但細胞自噬卻會賦予**順鉑抗藥性，對下咽鱗*的**帶來不利影響。本文作者使用了下咽鱗*細胞系FaDu 和具有順鉑抗藥性的下咽鱗*細胞系FaDu/DDP 作為實驗對象，進行了環狀 DNA 的circle-seq以及全轉錄組測序，并通過 Sanger 測序和 qPCR 驗證了 RAB3B 基因所在的環狀 DNA 的真實存在，發現 eccDNA 上的 RAB3B 基因可通過誘導細胞自噬而賦予下咽鱗*細胞順鉑抗性。下面我們就來了解一下本文的具體研究思路：
eccDNA 表達譜
研究者首先研究了FaDu 細胞和具有抗藥性的FaDu/DDP 細胞的 eccDNA 表達譜（生物學重復 3 vs 3）。云序生物提供了 eccDNA 的circle-seq服務：細胞樣品中的 DNA 被提取后，通過 A&A 環狀 DNA 純化柱純化，而后外切酶消化線性 DNA，隨后對剩余的環狀 DNA 進行滾換擴增，**經過超聲打斷后建庫測序。在FaDu 細胞和具有抗藥性的FaDu/DDP 細胞中均有檢測到一萬個左右的 eccDNA，其中有幾千個 eccDNA 含有基因。研究者還對 eccDNA 的長度進行了統計，發現其分布范圍從 0.01 kb 到 1000 kb 不等，但在 0.1 kb 和 0.7 kb 附近有兩個明顯的長度峰的存在。以上這些 eccDNA 表達譜特征在 FaDu 細胞和具有抗藥性的FaDu/DDP 細胞都很相似。
在具有抗藥性的FaDu/DDP 細胞中，很大比例（2366/9773）的 eccDNA 上沒有基因，較大比例（1958/9773）的 eccDNA 上*有 1 個基因，但也有 4 個 eccDNA 上具有多達 8 個基因。絕大多數的 eccDNA 基因（3779/5201）*在 1 種 eccDNA 上發現，但也有 5 個基因在多達 6 種 eccDNA 上發現，甚至更有 1 個基因（CUX1）在多達 8 種 eccDNA 上發現。在 FaDu 細胞中也可以觀察到類似的 eccDNA 基因分布趨勢。
圖1. FaDu 細胞和FaDu/DDP 細胞的 eccDNA 表達譜特征
抗藥細胞系的 eccDNA 表達特征
研究者還進一步比較了FaDu 細胞和具有抗藥性的FaDu/DDP 細胞的 eccDNA 在各條染色體上的分布，除了個別染色體以外，整體而言沒有發現兩個細胞系之間的明顯差異。在各條染色體之間比較 eccDNA 的分布密度，發現基因密度高的 19 號染色體具有**的 eccDNA 密度，而基因密度低的 Y 染色體則具有**的 eccDNA 密度。在FaDu 細胞和具有抗藥性的FaDu/DDP 細胞之間，找出了 1163 個 eccDNA 上的 2307 個差異表達的 eccDNA（Differentially Expressed EccDNAs，簡稱 DEEDs）。根據這些 DEEDs 進行的 KEGG pathway 和 GO 生物信息學分析顯示，多個與抗藥性相關的 KEGG 通路中存在**上調或下調的 DEEDs 上的基因，多個與細胞抗藥性相關的 GO 條目也富集有 DEEDs 上的基因，提示FaDu 細胞和 FaDu/DDP 細胞之間的 eccDNA 基因表達差異可能是導致其抗藥性差異的原因。
圖2.差異表達的 eccDNA 和基因
轉錄譜與 eccDNA 表達譜之間的聯合分析
研究者除了進行 circle-seq 檢測 eccDNA 以外，還對 FaDu 細胞和具有抗藥性的FaDu/DDP 細胞進行了全轉錄組測序。將全轉錄組測序和 circle-seq 進行聯合分析，就可以找出兩種細胞系之間 mRNA 表達量發生**變化且 eccDNA 量也發生**變化的基因。其**找到了 7 個 eccDNA 上的 24 個序列完整的基因，它們的 mRNA 和 eccDNA 表達量都在抗藥細胞系中**上調；10 個 eccDNA 上的 11 個序列完整的基因，它們的 mRNA 和 eccDNA 表達量都在抗藥細胞系中**下調。
驗證 eccDNA 的真實存在
為了驗證 circle-seq 中分析出的 eccDNA 是否真的以環狀的形式存在，研究者選用多個不同類型的 eccDNA 進行了成環位點的Sanger測序驗證以及環狀 DNA 的qPCR 驗證實驗。實驗結果證明，三個帶有蛋白編碼基因的 eccDNA 都在細胞中真實存在。其中有一個被證明真實存在的環狀 DNA 上帶有 RAB3B 基因。
圖3.含有 RAB3B 完整基因的 eccDNA 被驗證真實存在
抗藥性是因為 RAB3B 基因引起的
為了找出導致FaDu/DDP 細胞抗藥性的關鍵基因，研究者選取了數個 mRNA 和 eccDNA 表達量都在抗藥細胞系中**上調的基因，分析它們的基因表達量與 GEPIA 和 TCGA 數據庫中 HNSCC 患者的總生存率之間的關系，結果發現*有 RAB3B 基因與患者的總生存率呈負相關。GEPIA 和 TCGA 測序數據庫中的信息還顯示，HNSCC 組織中的 RAB3B 基因的表達量也發生了**上調。因此，研究者認為 RAB3B 基因很可能是導致 HNSCC 患者抗藥性和低生存率的原因。為了驗證這一假設，研究者隨后以 RAB3B 基因為變量，研究 RAB3B 基因與順鉑抗藥性之間的關系。
圖4. RAB3B 基因關聯較差的 HNSCC 疾病預后以及較強的 DDP 抗藥性
RAB3B 可誘導下咽鱗*細胞產生自噬介導的抗藥性
RAB3B 屬于小G蛋白 RAB 家族，參與了細胞自噬和抗藥性的生物過程，作為一個*基因在多種*癥中被發現報道，但先前并無科學家證明過 RAB3B 在 HSCC 中的致病作用。
本篇論文的研究者用 qPCR 以及 Western Blot 的方法在 FaDu 和 FaDu/DDP 細胞中檢測了 RAB3B 的 mRNA 和蛋白表達水平，發現其在抗藥性細胞FaDu/DDP 當中的表達**上調。通過 shRNA 敲降和質粒過表達來降低或升高FaDu/DDP 細胞中的 RAB3B 的表達水平，研究者發現敲降 RAB3B 將會降低細胞對 DDP 的抗藥性（IC50 降低），而過表達 RAB3B 則會升高細胞對 DDP 的抗藥性（IC50升高）。同時，對細胞自噬標志物 LC3-I 和細胞自噬特異性底物 p62 的 Western Blot 檢測結果顯示，細胞自噬標志物 LC3-I 到 LC3-II 的轉化在 RAB3B 表達時上調，而自噬特異性底物 p62 則在 RAB3B 表達時下調，說明 RAB3B 可以促進細胞自噬的發生。電鏡觀察顯示，RAB3B 敲降細胞中的自噬囊泡**減少，也說明 RAB3B 可以促進細胞自噬的發生。研究者還構建了下咽鱗*的**類**（ Patient-derived tumor organoid，簡稱 PDO），結果發現順鉑藥物處理加上 RAB3B 敲降可對下咽鱗* PDO 造成****的打擊。
綜上可以得出結論，在體外環境下，RAB3B 可以誘導細胞自噬，進而產生順鉑抗藥性。
圖5. RAB3B 可誘導下咽鱗*細胞產生自噬介導的抗藥性
小結
本論文的研究者通過環狀 DNA 測序/circle-seq 和全轉錄組測序聯合分析，找到了一個包含 RAB3B 基因完整序列的 eccDNA 在順鉑抗性細胞系中**高表達。體外實驗可以證明，RAB3B 可以通過細胞自噬機制賦予細胞順鉑抗藥性。由此，研究者推論認為，很可能是因為 RAB3B 的 eccDNA 高表達，轉錄翻譯了大量的 RAB3B 蛋白，通過有誘導細胞自噬機制，*終賦予了細胞順鉑抗藥性。
圖6. eccDNA在FaDu細胞的DDP抗性中的作用和機制示意圖
云序生物 eccDNA 測序
云序生物是國內*早提供環狀DNA測序服務的公司，早在2018年已啟動了環狀 DNA 測序技術的開發。2019年，云序率先發布了組織細胞環狀 DNA 測序（circle-seq），并成為A&A Bio**代理（該品牌的環狀 DNA 純化柱被絕大部分環狀DNA高分文章采用）。2020年，云序又相繼發布了血清血漿環狀DNA測序及血清血漿環狀DNA甲基化測序服務，均為全國**，并成為國內環狀DNA產品線*全的測序公司。迄今為止，我們已經完成上千例樣品的環狀DNA測序，積累了豐富的項目經驗，樣品類型涵蓋：組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等，物種涵蓋：人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。
云序生物 eccDNA 相關產品
1.組織細胞環狀DNA測序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號，高效地純化和富集環狀DNA，再利用NGS測序和生信分析識別環狀DNA。結合優化的實驗流程，本環狀DNA測序服務具有檢出率高﹑準確性好等優點。
技術優勢：
- 使用原裝A&A biotechnology純化柱高效富集環狀DNA
- 滾環擴增放大環狀DNA信號，提高檢出率
- 專業的生信分析：詳盡的注釋、豐富的圖表
云序生物eccDNA測序實驗示意圖
2.血清血漿環狀DNA測序
針對血清血漿微量樣品，云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開eccDNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高，損耗低，實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量，使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。
技術優勢：
- 減少DNA損失
- 保留原始表達量，不同環狀DNA間表達量比較更準確
3.血清血漿環狀DNA甲基化測序
針對血清血漿樣品，云序參考盧煜明教授團隊今年研發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開環狀DNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，并用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U，進行建庫及測序。一次建庫測序中同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化位點的信息。
- 一箭雙雕：同時檢測環狀DNA及其甲基化狀況，節約樣品，性價比高
- 單堿基分辨的環狀DNA甲基化分析
針對測序項目中篩選出的環狀DNA，云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。其主要目的在于：為用戶提供一種低成本的擴大樣品量驗證手段，節約實驗成本。通過設計反向引物進行PCR擴增，將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序，驗證連接位點處序列。
5.A&A Biotechnology 環狀 DNA 純化柱
A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分環狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內的**總代理。
云序生物服務優勢
優勢一：國內**提供環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序的公司，至今已經發表3篇高質量環狀DNA測序SCI論文。
優勢二：環狀DNA相關服務產品線*全的公司。
優勢三： A&A Biotechnology 總代理，采用原裝A&A Bio純化柱，環狀DNA 純化效果好。
優勢四：一站式服務：您只需按照送樣要求向云序生物寄送樣品，我們就能為您完成從環狀DNA 提取，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。
優勢五：嚴格質控流程：云序生物質控流程嚴格，層層把關，為客戶提供高準確度的結果。
優勢六：專業化生物信息分析：云序生物強大生物信息團隊，滿足客戶個性化數據分析要求。
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