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又一篇！云序circle-seq助力環狀DNA在食管鱗ai當中的研究
ding尖國際學術期刊《Nature》和《Cell》上相繼發表了染色體外環狀DNA(extrachromosomal circular DNA，eccDNA)促進****發生的報道使eccDNA成為了基因組學研究的“明星”分子。云序生物緊跟“潮流”，是國內***早提供eccDNA測序服務并且weiyi有10分以上文章發表的環狀 DNA 測序（circle-seq）服務平臺的公司。近期，云序客戶連發兩篇eccDNA文章，既包括多組學聯合分析類文章（國內首篇，15分！云序circle-seq助力國內首篇10分以上環狀DNA研究）
文章導讀
ding尖國際學術期刊《Nature》和《Cell》上相繼發表了染色體外環狀DNA(extrachromosomal circular DNA，eccDNA)促進****發生的報道使eccDNA成為了基因組學研究的“明星”分子。云序生物緊跟“潮流”，是國內***早提供eccDNA測序服務并且weiyi有10分以上文章發表的環狀 DNA 測序（circle-seq）服務平臺的公司。近期，云序客戶連發兩篇eccDNA文章，既包括多組學聯合分析類文章（IF:15分！云序circle-seq助力10分以上環狀DNA研究），又有單純測序發表的文章（山東大學齊魯醫院田輝教授團隊在Annals of TranslationalMedicine期刊上發表了eccDNA表達譜文章）。通過circle-seq等高通量測序技術，作者**揭示了食管鱗ai中的eccDNA表達譜，并探究了eccDNA在食管鱗ai中的潛在機制，為食管鱗ai的臨床診斷、**等提供了進一步的見解。*通過測序數據分析，加上qPCR和Sanger測序驗證，就可以在3-6個月內短、平、快發表文章！
發表日期：2021年9月9日
樣本數量：ai組織 vsai旁組織（3 vs 3）
研究方法: 環狀 DNA 測序（circle-seq）、環狀DNA Sanger測序
文章鏈接：Extrachromosomal circular DNAs are commonand functional in esophageal squamous cell carcinoma
技術路線
研究背景
食管鱗ai是ai癥相關死亡的主要原因。食道ai在ai癥的發病率排名第七，在世界范圍內ai癥相關的死亡率第六。迄今為止，食管鱗ai高發病率和預后差的分子機制尚未完全闡明。雖然***近的研究已經證明了eccDNA在各種****中的存在，但迄今為止，還沒有探究eccDNA在食管鱗ai中的分布和功能。***近，高通量測序表明，在母體和胎兒血漿中eccDNA的大小分布是不同的。此外，肺ai樣本中發現的eccDNA比配對正常組織中的更長，并且肺ai手術切除后血漿中循環eccDNA數量減少。這些研究提示，eccDNA的分布可能與****細胞譜系和某些惡性****的形成有關。此外，通過對包括食管鱗ai在內的各種****類型的泛ai分析，數以萬計的攜帶已知ai癥驅動基因的eccDNA被識別出來，不過主要集中在****細胞系或組織樣本上，缺乏食管鱗ai和配對正常食管上皮組織中eccDNA分布模式的比較。
研究內容
（1）食管鱗ai組織中的eccDNA分布作者首先通過circle-seq高通量測序技術檢測食管鱗ai和配對正常食管上皮組織中的eccDNA。eccDNA頻率在每條染色體中基本相同，但Y染色體的eccDNA頻率要低得多。編碼基因數量與各染色體上eccDNA分布頻率均無相關性。此外，eccDNA在基因組上的分布主要集中在5’UTR和3’UTR，其次是基因上下2kb以及CpG島上下2kb。eccDNA全長分布范圍為33~968842 bp，95.0%(175363/184557)的eccDNA短于3000bp, 86.1%(158850/184557)短于2000 bp。
接下來，作者根據測序結果對eccDNA在食管鱗ai、正常食管上皮組織中的分布進行了比較。維恩圖顯示，在184557個eccDNA中，有65809個eccDNA*在食管鱗ai樣本中檢測到，4520個eccDNA*在正常食管上皮中檢測到，114228個eccDNA兩者共有，但兩組樣本eccDNA的染色體、基因組以及長度分布模式相似。
（3）食管鱗ai和配對正常食管上皮組織之間差異表達的eccDNA鑒定
分析了兩組樣本的eccDNA分布模式后，作者接著比較了食管鱗ai和正常食管上皮中eccDNA的表達水平差異。共有16031個差異表達的eccDNA（P-value<0.05 ，|LogFC| >1），其中上調10126個，下調5905個；且只有一小部分差異eccDNA（候選功能性eccDNA）在食管鱗ai和正常食管樣本中均檢測到。這些候選eccDNA可能是食管鱗ai的潛在生物標志物，并可能參與食管鱗ai的發生和發展。其長度分布范圍為44~395,264 bp，且它們主要來自5'UTR和3'UTR。經過分析發現這些上調的eccDNA來源于3219個基因，主要是轉錄和發育調節因子2（AUTS2）基因。下調的eccDNA來自2235個基因，其中LSAMP、CUB和CSMD1和BICD1基因產生的eccDNA***多。
（4） 差異表達eccDNA相關基因的GO和KEGG通路分析
為了探究差異表達eccDNA相關基因的功能，進行了GO和KEGG分析。發現這些基因主要與神經元、GTPase相關活性和細胞骨架等有關。此外，KEGG通路分析顯示，差異表達的eccDNA相關基因主要涉及ai癥相關通路、促絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、局灶粘附和Rap1通路。
（5）食管鱗ai樣品中eccDNA的驗證
作者接著挑選了部分eccDNA進行PCR驗證，包括5個上調和下調的指標。其中，5個上調的eccDNA在至少一種****樣本中強烈表達，而在所有正常上皮樣本中均為陰性。同時，5個下調的eccdna在所有****樣本和正常上皮樣本中均為陰性。為分析其原因，將高通量測序數據與PCR結果進行了比較，發現只有原始表達值高的eccDNA分子能在PCR中檢測到。
為探討eccDNA的產生機制，對每個eccDNA起始和結束位置上游10 bp至下游10 bp的核苷酸組成進行了motif分析。有趣的是，在起始位點和結束位點之間檢測到重復的核苷酸模式，這種核苷酸模式可能是導致eccDNA形成的原因。
云序生物eccDNA測序
云序生物是國內***早提供環狀DNA測序服務的公司，早在2018年已啟動了環狀DNA測序技術的開發。2019年，云序率先發布了組織細胞環狀 DNA 測序（circle-seq），并成為A&A Bio**代理（該品牌的環狀 DNA 純化柱被絕大部分環狀DNA高分文章采用）。2020年，云序又相繼發布了血清血漿環狀DNA測序及血清血漿環狀DNA甲基化測序服務，均為全國**，并成為國內環狀DNA產品線***全的測序公司。迄今為止，我們已經完成上千例樣品的環狀DNA測序，積累了豐富的項目經驗，樣品類型涵蓋：組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等，物種涵蓋：人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。
云序生物eccDNA相關產品
云序生物基于circle-seq的方法，采用多種手段包括柱純化去除基因組DNA、酶消化去除線性DNA和線粒體DNA、滾環擴增放大信號，高效地純化和富集環狀DNA，再利用NGS測序和生信分析識別環狀DNA。結合優化的實驗流程，本環狀DNA測序服務具有檢出率高﹑準確性好等優點。
云序生物eccDNA測序實驗示意圖
技術優勢：
- 使用原裝A&A biotechnology純化柱高效富集環狀DNA
- 滾環擴增放大環狀DNA信號，提高檢出率
- 專業的生信分析：詳盡的注釋、豐富的圖表
針對血清血漿微量樣品，云序生物參考盧煜明教授團隊開發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開eccDNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，進行建庫及測序。Tn5轉座酶法效率高，損耗低，實現血液循環系統中微量的環狀DNA的檢測。并且本產品能保留環狀DNA的原始表達量，使得不同環狀DNA間的表達量的比較更為準確。
技術優勢：
- 減少DNA損失
- 保留原始表達量，不同環狀DNA間表達量比較更準確
針對血清血漿樣品，云序參考盧煜明教授團隊今年研發的方法，酶切去除線性DNA后，利用Tn5轉座酶，打開環狀DNA環狀結構并同時在DN**段兩端加上接頭，并用酶轉化法將未甲基化的C轉化為U，進行建庫及測序。一次建庫測序中同時檢測樣品中環狀DNA及其甲基化位點的信息。
- 一箭雙雕：同時檢測環狀DNA及其甲基化狀況，節約樣品，性價比高
- 單堿基分辨的環狀DNA甲基化分析
針對測序項目中篩選出的環狀DNA，云序提供sanger測序服務驗證環狀結構。其主要目的在于：為用戶提供一種低成本的擴大樣品量驗證手段，節約實驗成本。通過設計反向引物進行PCR擴增，將覆蓋環狀DNA連接位點的擴增產物進行sanger測序，驗證連接位點處序列。
5.A&A Biotechnology 環狀 DNA 純化柱
A&A Biotechnology的純化柱，是絕大部分環狀DNA高分文章中所使用的純化柱。云序生物是該品牌在國內的weiyi總代理。
云序生物服務優勢
優勢一：**提供環狀DNA測序服務和環狀DNA甲基化測序的公司。
優勢二：環狀DNA相關服務產品線***全的公司。
優勢三： A&A Biotechnology 總代理，采用原裝A&A Bio純化柱，環狀DNA 純化效果好。
優勢四：一站式服務：您只需按照送樣要求向云序生物寄送樣品，我們就能為您完成從環狀DNA 提取，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。
優勢五：嚴格質控流程：云序生物質控流程嚴格，層層把關，為客戶提供高準確度的結果。
優勢六：專業化生物信息分析：云序生物強大生物信息團隊，滿足客戶個性化數據分析要求。
往期eccDNA主題回顧
Nature新發現—斯坦福大學揭示****細胞內ecDNA新機制！
上海云序生物科技有限公司
Shanghai Cloud-seq Biotech Co., Ltd
地址：上海市松江區莘磚公路518號18號樓2樓
網址：http://www.cccppp1.com
電話：021-64878766
郵箱：market@cloud-seq.com.cn
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未來，公司將致力于高通量技術在疾病預測、診斷、個性化醫療等方面的應用和開發，致力于為國內外科研和醫療用戶提供先進的高通量檢測系統解決方案。
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