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IF:17分｜云序circle-seq助力10分以上環狀DNA研究
19年以來，染色體外環狀DNA（extrachromosomal circular DNA）連續登上Nature，Cell等重磅期刊，成為了**的前沿熱點。近日，云序客戶鄭州大學王立東教授團隊在環狀DNA領域取得重大突破，在國際**期刊Nature Communications（IF=17.69）上發表了環狀DNA成果。云序生物也成為國內**并且**有10分以上文章發表的環狀 DNA 測序（circle-seq）服務平臺。通過circle-seq等高通量測序技術，作者揭示了賁門*中ERBB2，EGFR等致*基因以環形DNA形式存在并形成了局部擴增，建立了ERBB2局部擴增與賁門*預后之間的關系
19年以來，染色體外環狀DNA（extrachromosomal circular DNA）連續登上Nature，Cell等重磅期刊，成為了**的前沿熱點。近日，云序客戶鄭州大學王立東教授團隊在環狀DNA領域取得重大突破，在國際**期刊Nature Communications（IF=17.69）上發表了環狀DNA成果。云序生物也成為國內shou家并且wei一有10分以上文章發表的
環狀DNA測序（circle-seq）
服務平臺。通過circle-seq等高通量測序技術，作者揭示了賁門*中ERBB2，EGFR等致*基因以環形DNA形式存在并形成了局部擴增，建立了ERBB2局部擴增與賁門*預后之間的關系。
發表期刊：Nature Communications
發表日期：2021年11月11日
影響因子：17.69
研究方法：環狀 DNA 測序（circle-seq）、全基因組測序、全外顯子測序、
文章鏈接：Focal amplifications are associated with chromothripsis events and diverse prognoses in gastric cardia adenocarcinoma
賁門位于食管和胃的交界處。食管胃結合部腺*（Esophagogastric junction adenocarcinoma）是指起源于上消化道腺上皮并侵犯食管胃結合部的腺***變。傳統上，根據形態解剖上的特征，Siewert 分型法將食管胃結合部腺*分為3型：Ⅰ型：遠端食管腺*，其范圍自齒狀線上5 cm至齒狀線上1 cm；Ⅱ型：真正意義的賁門腺*，范圍自齒狀線近心端1 cm至遠心端2 cm內；Ⅲ型：賁門下腺*，自齒狀線下2～5 cm。目前，東西方學者對于如何定義食管胃結合部腺*仍存在爭議。在西方國家，因為巴雷特食管（Barrett’s esophagus，BE）病變高發，發生在食管和胃結合部的腺*往往被診斷為 Siewert II 型食管胃結合部腺*（Esophagogastric junction adenocarcinoma）。然而，在中國的太行山區的胃賁門腺*（Gastric cardia adenocarcinom，后文簡稱為賁門*）患者中，巴雷特食管病變的發生率很低，此地的賁門*反而與食管鱗*（esophageal squamous cell carcinoma）更具相似性。
研究者首先對 36 例賁門*組織進行了全基因組測序（WGS），通過 AmpliconArchitect 軟件分析基因拷貝數異變（CNV）和局部擴增（Focal Amplifications）的情況。共計 28 位病人的 WGS 分析中有檢出局部擴增現象，比例高達 77.8%（28/36），與其它研究報道中食管*的局部擴增的比例（約 80%）相仿，但高于胃*中局部擴增的比例（約 50%）。
使用 AmpliconArchitect 軟件，研究者進一步將局部擴增的類型細分為環狀 DNA 型、線性 DNA 型、復雜型、“斷裂-融合-橋”型以及其它。對于其中的環狀 DNA 型局部擴增，研究者使用另一種軟件 Circle-finder 進行了**驗證，發現 AmpliconArchitect 方法所發現的環狀 DNA 絕大多數都能在 Circle-finder 中驗證（Fig1），說明軟件對環狀 DNA 的預測是真實可靠的。
隨后，研究者對所有的局部擴增位點進行了基因組注釋，發現其中絕大多數位點位于蛋白質編碼區；除此以外，局部擴增在lncRNA 基因區、miRNA 基因區、snRNA 基因區、snoRNA基因區、rRNA 基因區等均有分布；值得注意的是，也有 82 個局部擴增事件發生在致*基因區域。
研究者對這些發生在致*區域的局部擴增事件進行了統計排序，發現發生在 CCNE1 基因的局部擴增事件的頻率**，ERBB2 基因緊隨其后，后文中扮演重要角色的 EGFR 基因上發生局部擴增事件的頻率也不低。研究者利用 TCGA 數據庫中的公開數據，在食管*、賁門*、胃*這三種臨床上相似的*癥之間，比較局部擴增事件出現在各致*基因上的頻率排序，發現賁門*與胃*近似（前兩名都是 CCNE1 和 ERBB2），但與食管*有差異。研究者進一步發生了局部擴增的對環狀 DNA 進行分類，將含有兩個或以上致*基因的環狀 DNA 的局部擴增稱為“共擴增”（co-amplification），單個致*基因來源的則為“非共擴增”（none co-amplification）。依照這一分類標準，可以發現：
（1）超過一半病人有發生兩個或以上致*基因的“共擴增”現象；
（2）在發生了“共擴增”的病人當中，”共擴增“在所有局部擴增事件中所占的比例很高，從50%到100%不等；
（3）有一些致*基因的“共擴增”組合，例如 ERBB2 和 CDK12 的組合，RARA 和 SMARCE1 的組合等，在多個病人當中發生；
（4）EGFR 和 CDK6 的“共擴增”組合，這兩個致*基因在基因組上的距離長達 40 Mbp，但仍形成了一個環狀DNA，并且其局部擴增水平相較于基因組其他區域高出了 40 倍之多。
以上現象強烈暗示，同一個環狀 DNA 上共擴增的多個致*基因，可在賁門*發展過程**同發揮作用。
二、環狀 DNA 測序驗證環狀局部擴增事件的真實性
為了驗證 AmpliconArchitect 軟件預測的環狀 DNA 型局部擴增事件的真實性，研究者將前述 36 位賁門*患者當中的 10 份賁門*組織及其*旁正常組織送來云序生物進行了環狀 DNA 測序（circle-seq）。在 circle-seq流程中，采用 A&A Biotechnology 的純化柱進行環狀DNA富集，并輔以外切酶消化，能**消除線性 DNA 的干擾，保留高純度的環狀 DNA 用于測序。在這 10 份樣品中，AmpliconArchitect軟件預測認為其中 4 份賁門*組織樣品發生了環狀 DNA 型局部擴增，另外 6 份賁門*組織樣品則沒有。Circle-seq 結果顯示，10 份賁門*組織中均有檢出環狀 DNA 的存在。對于 4 份軟件預測認為存在環狀 DNA 型局部擴增的賁門*樣品，絕大多數原先預測存在的環狀 DNA 都被 Circ-seq 驗證發現真實存在。對于局部擴增頻率**的致*基因 CCNE1，在 2 份樣品中，Circle-seq 實驗結果和 AmpliconArchitect 軟件預測都認為 CCNE1 發生了局部擴增；但在所有的正常組織樣品中，Circle-seq 和 AmpliconArchitect 軟件預測都認為不存在 CCNE1 的局部擴增事件——這進一步驗證了 AmpliconArchitec 軟件預測的可靠性。
那么，6 份基于 WGS 數據進行軟件預測認為沒有發生環狀 DNA型局部擴增的賁門*組織樣品，為何在 Circle-seq 當中也檢出了環狀 DNA 的存在呢？原來，環狀 DNA 可以被細分為 ecDNA 和 eccDNA，其中 ecDNA 長度較長、拷貝數較高（本文定義為拷貝數>=7），大量研究已經證明 ecDNA 與**的發展和耐藥性有關；eccDNA 長度較短、拷貝數較低（本文定義為拷貝數<7），在真核細胞當中普遍存在，與**的關系不大。在本研究中，在6份基于 WGS 數據進行軟件預測認為沒有發生環狀 DNA型局部擴增的賁門*組織樣品里面，有 4 份當中的環狀 DNA 全都是與**無關的 eccDNA（S21、S28、S29、S32），因此 AmpliconArchitect 軟件其實相對準確地預測出了與**息息相關的 ecDNA 的存在。
三、染色體碎裂是局部擴增的原因
雖然局部擴增現象在多種*癥中都已被發現，但造成局部擴增事件發生的原因，仍然撲朔迷離。"染色體碎裂"（Chromothripsis ，或 Chromosome shattering）是染色體的大片區域發生大規模的重新排列的現象。染色體碎裂使得染色體小片段重新排列，并重新連接，導致形成新的基因組配置。有文獻報道認為，染色體碎裂促使來自不同染色**點的 DNA 重排片段并列在一起，有助于*癥的進展。并且，在染色體碎裂的過程中，伴隨有局部擴增事件以及 ecDNA 擴增子的發生。
因此，研究者下一步就探究了賁門*中染色體碎裂與局部擴增事件之間的關系。對于前述的 36 例賁門* WGS 測序數據，研究者使用 ShatterSeek 軟件包鑒定其中的染色體碎裂事件，發現其中 34 例個案發生了染色體碎裂。研究者進一步制定標準將染色體碎裂事件細分為“高可信度染色體碎裂”（HC）和“低可信度染色體碎裂”（LC），發現高達61%的個案中存在 HC 事件，而 LC 事件更是在接近 90% 的個案中存在。然而，這些染色體碎裂事件的發生次數以及染色**置卻不存在特征規律，在不同個案之間差異很大。作者隨后比較了染色體碎裂以及局部擴增發生的染色**置，發現二者在多個致*基因處都有發生。統計顯示，總計有高達 33.11% 的局部擴增事件發生的位點處也發生了染色體碎裂事件，染色體碎裂與局部擴增之間皮爾森關聯系數達到 0.42，暗示染色體碎裂很可能是局部擴增發生的一種重要來源。由此，作者推測認為，在賁門*中，很可能是因為染色體的碎裂，引發了局部擴增事件的增加，進而促進了賁門*的發展。
四、亞硝胺引發的DNA 損傷是染色體碎裂的原因
那么，又是什么原因導致了染色體的碎裂呢？早前的研究顯示，染色體碎裂與基因組的不穩定性以及 DNA 損傷有關。研究者對多種可能造成基因組不穩定和 DNA 損傷的原因進行了逐一排查，排除了微衛星不穩定性（MSI）和染色體不穩定性（CIN）在賁門*中造成染色體碎裂的可能性，但發現 DNA 雙鏈斷裂與賁門*高度相關——在 34 例發生了染色體碎裂的個案當中，有 29 例通過免疫組化實驗檢出了 DNA 雙鏈斷裂的指標蛋白 γH2AX；并且，在唯二未發生染色體碎裂事件的個案中，均未檢出 γH2AX，說明 DNA 雙鏈斷裂指標蛋白 γH2AX 與染色體碎裂事件的發生高度正相關。研究者還發現，γH2AX 陽性個案當中的染色體碎片長度比 γH2AX 陰性個案中更長，與先前提到的*癥相關的 ecDNA 長度更長的特征不謀而合。因此，作者推測，在賁門*中，很可能是因為 DNA 雙鏈的斷裂，引發了染色體碎裂事件的增加，進而促進了賁門*的發展。
追根溯源，那么究竟又是什么原因導致賁門*患者的 DNA 雙鏈發生斷裂呢？作者觀察到，原來本研究中所收集的賁門*病例，均來自中國河南省的太行山區，該地區是賁門*的高發區域。太行山區的居民喜食酸菜等富含DNA 烷化劑亞硝胺的食物，作者推測認為，很可能是因為當地居民的飲食傳統導致了亞硝胺的攝入過量，進而引發 DNA 損傷-染色體碎裂-局部擴增，***終導致了賁門*的高發。
五、不同的致*基因局部擴增對賁門*的預后有不同的影響
在多種*癥中都有研究報道，ecDNA 與致*基因的擴增以及*癥的不良預后高度相關。沿著這一思路，研究者在賁門*中，探究了致*基因拷貝數、局部擴增事件、病人預后情況三者之間的關系。
首先，研究者考查了致*基因拷貝數與賁門*與預后之間的關系。在賁門*的 11 個出現頻率**的致*基因當中，研究者將這些致*基因在各個賁門*病人中的拷貝數分為高、中、低三檔，發現局部擴增的致*基因的拷貝數普遍較高。對于 EGFR、MYC、BIRC3 這幾個致*基因，高拷貝數預示著病人較短的存活時長；然而，對于CCNE1、ERBB2 等致*基因，高拷貝數卻預示著病人較長的存活時長。
為了更好地確認致*基因拷貝數與賁門*病人存活時長之間的關系，研究者在前述 36 例賁門*病人的基礎上，額外追加了另外 39 例賁門*病人，對共計 75 例病人進行了全外顯子測序（WES）。結果顯示，36 例進行了兩種測序的個案當中，WGS 和 WES 檢出的致*基因拷貝數基本吻合，說明前述基于 WGS 數據所做的研究是可靠的；全體 75 例賁門*病人的 WES 結果也顯示，ERBB2 的擴增預示著病人較長的存活時長。除此之外，作者還從 TCGA 數據庫中獲取公開病例數據，在賁門*病人中，EGFR 高拷貝病人存活時間短，ERBB2 和 CCNE1 高拷貝病人存活時間長，與之前發現的規律相同。由此說明，作者先前得出的致*基因拷貝數與病人存活時長之間的規律關系是具有普適性的，并非先前 36 例小范圍樣本中的個別現象。
隨后，研究者又考查了致*基因局部擴增事件與賁門*預后之間的關系。CCNE1 的局部擴增與病人預后之間沒有**相關關系；EGFR 的局部擴增預示著較短的存活時長；而 ERBB2 的局部擴增則預示著較長的存活時長。
研究者試圖將致*基因 ERBB2 對賁門*預后的影響精確到詳細的*癥分期，但因為測序研究的樣本量太小，不足以得出統計學上有說服力的結論。雖然缺乏大規模的賁門*測序研究的機會，但鄭州大學**附屬醫院自1973 年以來，收集了數以千計的賁門*樣本。研究者從 1668 份賁門*樣本進行了免疫組化實驗，檢驗其中是否存在 ERBB2 蛋白的表達。對于術后存活時長超過兩年的個案而言，免疫組化 ERBB2 陽性的患者的生存率要高于ERBB2 陰性的患者。研究者先前已經發現， ERBB2 的蛋白表達水平與 RNA 表達水平之間的皮爾森關聯系數高達0.79，具有很強的正相關關系。假若 ERBB2 的局部擴增可導致 ERBB2 蛋白的表達水平升高，那么 ERBB2 局部擴增或將可在臨床實踐中作為賁門*良好預后的一個生物標志物。有文獻報道，食道鱗*當中的 ERBB2 蛋白表達水平也與患者的生存率正相關，由此也暗示了賁門*與食道*之間的相似性。
近年來，由于實驗技術和生信分析技術的進步，環狀DNA相關研究發表 SCI 論文的數量呈井噴之勢增長。PubMed 搜索數據顯示，2017 年環狀DNA 相關論文全世界* 4 篇，后續幾年逐步增長為 6、7、10 篇，而到了現在的 2021 年，***個月，就已經有 15 篇 環狀DNA 相關論文見刊，其中還不乏 Nature、Cancer Cell 等高分期刊，環狀DNA已成為生命科學的**科研熱點之一。
云序生物是國內***早提供環狀DNA測序服務的公司，早在2018年已啟動了環狀DNA測序技術的開發。2019年，云序率先發布了組織細胞環狀 DNA 測序（circle-seq），，并成為A&A Bio**代理（該品牌的環狀 DNA 純化柱被絕大部分環狀DNA高分文章采用）。2020年，云序又相繼發布了血清血漿環狀DNA測序及血清血漿環狀DNA甲基化測序服務，均為全國shou發，并成為國內環狀DNA產品線***全的測序公司。迄今為止，我們已經完成上千例樣品的環狀 DNA 測序，積累了豐富的項目經驗，樣品類型涵蓋：組織﹑細胞﹑血清﹑血漿﹑尿液等，物種涵蓋：人﹑小鼠﹑大鼠﹑擬南芥﹑果蠅﹑酵母﹑非洲爪蟾等。
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發表日期：2021年11月11日
影響因子：17.69
研究方法：環狀 DNA 測序（circle-seq）、全基因組測序、全外顯子測序、
文章鏈接：Focal amplifications are associated with chromothripsis events and diverse prognoses in gastric cardia adenocarcinoma
技術路線
研究背景
真核生物當中的染色體外環狀 DNA ***早發現于半個多世紀以前，長期以來被認為與基因組的不穩定性有關。隨著高通量測序技術的逐漸普及，越來越多的染色體外環狀 DNA 被發現。在**研究中，ecDNA 表現出作為**內分區標志物以及**發展分期標志物的潛能。許多全基因組測序的數據分析表明，ecDNA 在不同***類型中具有特異性，并且與致*基因的擴增以及*癥患者的不良預后存在關聯。在*細胞當中，不同染色**點之間可能發生重排、連接和擴增，引發基因組的“局部擴增”（Focal amplification）。早前的研究顯示，超過半數的**樣本中的局部擴增事件，可以用 ecDNA 來解釋。因此，在臨床**樣品中檢測基因組的局部擴增現象，對于理解 ecDNA 在**中的功能具有重大意義。賁門位于食管和胃的交界處。食管胃結合部腺*（Esophagogastric junction adenocarcinoma）是指起源于上消化道腺上皮并侵犯食管胃結合部的腺***變。傳統上，根據形態解剖上的特征，Siewert 分型法將食管胃結合部腺*分為3型：Ⅰ型：遠端食管腺*，其范圍自齒狀線上5 cm至齒狀線上1 cm；Ⅱ型：真正意義的賁門腺*，范圍自齒狀線近心端1 cm至遠心端2 cm內；Ⅲ型：賁門下腺*，自齒狀線下2～5 cm。目前，東西方學者對于如何定義食管胃結合部腺*仍存在爭議。在西方國家，因為巴雷特食管（Barrett’s esophagus，BE）病變高發，發生在食管和胃結合部的腺*往往被診斷為 Siewert II 型食管胃結合部腺*（Esophagogastric junction adenocarcinoma）。然而，在中國的太行山區的胃賁門腺*（Gastric cardia adenocarcinom，后文簡稱為賁門*）患者中，巴雷特食管病變的發生率很低，此地的賁門*反而與食管鱗*（esophageal squamous cell carcinoma）更具相似性。
研究內容
一、全基因組測序發現局部擴增現象研究者首先對 36 例賁門*組織進行了全基因組測序（WGS），通過 AmpliconArchitect 軟件分析基因拷貝數異變（CNV）和局部擴增（Focal Amplifications）的情況。共計 28 位病人的 WGS 分析中有檢出局部擴增現象，比例高達 77.8%（28/36），與其它研究報道中食管*的局部擴增的比例（約 80%）相仿，但高于胃*中局部擴增的比例（約 50%）。
圖1.36 位賁門*病人中有 28 位發生了局部擴增
使用 AmpliconArchitect 軟件，研究者進一步將局部擴增的類型細分為環狀 DNA 型、線性 DNA 型、復雜型、“斷裂-融合-橋”型以及其它。對于其中的環狀 DNA 型局部擴增，研究者使用另一種軟件 Circle-finder 進行了**驗證，發現 AmpliconArchitect 方法所發現的環狀 DNA 絕大多數都能在 Circle-finder 中驗證（Fig1），說明軟件對環狀 DNA 的預測是真實可靠的。
圖2.AmpliconArchitect 發現的環狀 DNA 絕大多數能被 Circle-finder 驗證
隨后，研究者對所有的局部擴增位點進行了基因組注釋，發現其中絕大多數位點位于蛋白質編碼區；除此以外，局部擴增在lncRNA 基因區、miRNA 基因區、snRNA 基因區、snoRNA基因區、rRNA 基因區等均有分布；值得注意的是，也有 82 個局部擴增事件發生在致*基因區域。
圖3. 局部擴增位的基因組區域注釋
研究者對這些發生在致*區域的局部擴增事件進行了統計排序，發現發生在 CCNE1 基因的局部擴增事件的頻率**，ERBB2 基因緊隨其后，后文中扮演重要角色的 EGFR 基因上發生局部擴增事件的頻率也不低。研究者利用 TCGA 數據庫中的公開數據，在食管*、賁門*、胃*這三種臨床上相似的*癥之間，比較局部擴增事件出現在各致*基因上的頻率排序，發現賁門*與胃*近似（前兩名都是 CCNE1 和 ERBB2），但與食管*有差異。研究者進一步發生了局部擴增的對環狀 DNA 進行分類，將含有兩個或以上致*基因的環狀 DNA 的局部擴增稱為“共擴增”（co-amplification），單個致*基因來源的則為“非共擴增”（none co-amplification）。依照這一分類標準，可以發現：
（1）超過一半病人有發生兩個或以上致*基因的“共擴增”現象；
（2）在發生了“共擴增”的病人當中，”共擴增“在所有局部擴增事件中所占的比例很高，從50%到100%不等；
（3）有一些致*基因的“共擴增”組合，例如 ERBB2 和 CDK12 的組合，RARA 和 SMARCE1 的組合等，在多個病人當中發生；
（4）EGFR 和 CDK6 的“共擴增”組合，這兩個致*基因在基因組上的距離長達 40 Mbp，但仍形成了一個環狀DNA，并且其局部擴增水平相較于基因組其他區域高出了 40 倍之多。
以上現象強烈暗示，同一個環狀 DNA 上共擴增的多個致*基因，可在賁門*發展過程**同發揮作用。
圖4.致病基因的“共擴增”現象在各個病例中的分布
圖5.致*基因 EGFR 和 CDK6 在同一個環狀 DNA 上共擴增
二、環狀 DNA 測序驗證環狀局部擴增事件的真實性
為了驗證 AmpliconArchitect 軟件預測的環狀 DNA 型局部擴增事件的真實性，研究者將前述 36 位賁門*患者當中的 10 份賁門*組織及其*旁正常組織送來云序生物進行了環狀 DNA 測序（circle-seq）。在 circle-seq流程中，采用 A&A Biotechnology 的純化柱進行環狀DNA富集，并輔以外切酶消化，能**消除線性 DNA 的干擾，保留高純度的環狀 DNA 用于測序。在這 10 份樣品中，AmpliconArchitect軟件預測認為其中 4 份賁門*組織樣品發生了環狀 DNA 型局部擴增，另外 6 份賁門*組織樣品則沒有。Circle-seq 結果顯示，10 份賁門*組織中均有檢出環狀 DNA 的存在。對于 4 份軟件預測認為存在環狀 DNA 型局部擴增的賁門*樣品，絕大多數原先預測存在的環狀 DNA 都被 Circ-seq 驗證發現真實存在。對于局部擴增頻率**的致*基因 CCNE1，在 2 份樣品中，Circle-seq 實驗結果和 AmpliconArchitect 軟件預測都認為 CCNE1 發生了局部擴增；但在所有的正常組織樣品中，Circle-seq 和 AmpliconArchitect 軟件預測都認為不存在 CCNE1 的局部擴增事件——這進一步驗證了 AmpliconArchitec 軟件預測的可靠性。
圖6.四例（S25、S26、S30、S31）AmpliconArchitect 軟件認為存在環狀 DNA 型局部擴增的病例當中，絕大多數環狀 DNA 都可被 Circle-seq 實驗結果驗證
那么，6 份基于 WGS 數據進行軟件預測認為沒有發生環狀 DNA型局部擴增的賁門*組織樣品，為何在 Circle-seq 當中也檢出了環狀 DNA 的存在呢？原來，環狀 DNA 可以被細分為 ecDNA 和 eccDNA，其中 ecDNA 長度較長、拷貝數較高（本文定義為拷貝數>=7），大量研究已經證明 ecDNA 與**的發展和耐藥性有關；eccDNA 長度較短、拷貝數較低（本文定義為拷貝數<7），在真核細胞當中普遍存在，與**的關系不大。在本研究中，在6份基于 WGS 數據進行軟件預測認為沒有發生環狀 DNA型局部擴增的賁門*組織樣品里面，有 4 份當中的環狀 DNA 全都是與**無關的 eccDNA（S21、S28、S29、S32），因此 AmpliconArchitect 軟件其實相對準確地預測出了與**息息相關的 ecDNA 的存在。
圖7.四個病例（S21、S28、S29、S32）當中 Circle-seq 檢測到的環狀 DNA 均為與**無關的eccDNA
三、染色體碎裂是局部擴增的原因
雖然局部擴增現象在多種*癥中都已被發現，但造成局部擴增事件發生的原因，仍然撲朔迷離。"染色體碎裂"（Chromothripsis ，或 Chromosome shattering）是染色體的大片區域發生大規模的重新排列的現象。染色體碎裂使得染色體小片段重新排列，并重新連接，導致形成新的基因組配置。有文獻報道認為，染色體碎裂促使來自不同染色**點的 DNA 重排片段并列在一起，有助于*癥的進展。并且，在染色體碎裂的過程中，伴隨有局部擴增事件以及 ecDNA 擴增子的發生。
因此，研究者下一步就探究了賁門*中染色體碎裂與局部擴增事件之間的關系。對于前述的 36 例賁門* WGS 測序數據，研究者使用 ShatterSeek 軟件包鑒定其中的染色體碎裂事件，發現其中 34 例個案發生了染色體碎裂。研究者進一步制定標準將染色體碎裂事件細分為“高可信度染色體碎裂”（HC）和“低可信度染色體碎裂”（LC），發現高達61%的個案中存在 HC 事件，而 LC 事件更是在接近 90% 的個案中存在。然而，這些染色體碎裂事件的發生次數以及染色**置卻不存在特征規律，在不同個案之間差異很大。作者隨后比較了染色體碎裂以及局部擴增發生的染色**置，發現二者在多個致*基因處都有發生。統計顯示，總計有高達 33.11% 的局部擴增事件發生的位點處也發生了染色體碎裂事件，染色體碎裂與局部擴增之間皮爾森關聯系數達到 0.42，暗示染色體碎裂很可能是局部擴增發生的一種重要來源。由此，作者推測認為，在賁門*中，很可能是因為染色體的碎裂，引發了局部擴增事件的增加，進而促進了賁門*的發展。
圖8.染色體碎裂與局部擴增之間存在正相關關系
四、亞硝胺引發的DNA 損傷是染色體碎裂的原因
那么，又是什么原因導致了染色體的碎裂呢？早前的研究顯示，染色體碎裂與基因組的不穩定性以及 DNA 損傷有關。研究者對多種可能造成基因組不穩定和 DNA 損傷的原因進行了逐一排查，排除了微衛星不穩定性（MSI）和染色體不穩定性（CIN）在賁門*中造成染色體碎裂的可能性，但發現 DNA 雙鏈斷裂與賁門*高度相關——在 34 例發生了染色體碎裂的個案當中，有 29 例通過免疫組化實驗檢出了 DNA 雙鏈斷裂的指標蛋白 γH2AX；并且，在唯二未發生染色體碎裂事件的個案中，均未檢出 γH2AX，說明 DNA 雙鏈斷裂指標蛋白 γH2AX 與染色體碎裂事件的發生高度正相關。研究者還發現，γH2AX 陽性個案當中的染色體碎片長度比 γH2AX 陰性個案中更長，與先前提到的*癥相關的 ecDNA 長度更長的特征不謀而合。因此，作者推測，在賁門*中，很可能是因為 DNA 雙鏈的斷裂，引發了染色體碎裂事件的增加，進而促進了賁門*的發展。
圖9. DNA 雙鏈斷裂指標蛋白 γH2AX 與染色體碎裂事件的發生高度正相關
追根溯源，那么究竟又是什么原因導致賁門*患者的 DNA 雙鏈發生斷裂呢？作者觀察到，原來本研究中所收集的賁門*病例，均來自中國河南省的太行山區，該地區是賁門*的高發區域。太行山區的居民喜食酸菜等富含DNA 烷化劑亞硝胺的食物，作者推測認為，很可能是因為當地居民的飲食傳統導致了亞硝胺的攝入過量，進而引發 DNA 損傷-染色體碎裂-局部擴增，***終導致了賁門*的高發。
在多種*癥中都有研究報道，ecDNA 與致*基因的擴增以及*癥的不良預后高度相關。沿著這一思路，研究者在賁門*中，探究了致*基因拷貝數、局部擴增事件、病人預后情況三者之間的關系。
首先，研究者考查了致*基因拷貝數與賁門*與預后之間的關系。在賁門*的 11 個出現頻率**的致*基因當中，研究者將這些致*基因在各個賁門*病人中的拷貝數分為高、中、低三檔，發現局部擴增的致*基因的拷貝數普遍較高。對于 EGFR、MYC、BIRC3 這幾個致*基因，高拷貝數預示著病人較短的存活時長；然而，對于CCNE1、ERBB2 等致*基因，高拷貝數卻預示著病人較長的存活時長。
圖10.基于 WGS 數據的局部擴增分析顯示，EGFR 高拷貝病人存活時間短，CCNE1、ERBB2 高拷貝病人存活時間長
為了更好地確認致*基因拷貝數與賁門*病人存活時長之間的關系，研究者在前述 36 例賁門*病人的基礎上，額外追加了另外 39 例賁門*病人，對共計 75 例病人進行了全外顯子測序（WES）。結果顯示，36 例進行了兩種測序的個案當中，WGS 和 WES 檢出的致*基因拷貝數基本吻合，說明前述基于 WGS 數據所做的研究是可靠的；全體 75 例賁門*病人的 WES 結果也顯示，ERBB2 的擴增預示著病人較長的存活時長。除此之外，作者還從 TCGA 數據庫中獲取公開病例數據，在賁門*病人中，EGFR 高拷貝病人存活時間短，ERBB2 和 CCNE1 高拷貝病人存活時間長，與之前發現的規律相同。由此說明，作者先前得出的致*基因拷貝數與病人存活時長之間的規律關系是具有普適性的，并非先前 36 例小范圍樣本中的個別現象。
圖11.ERBB2 基因的拷貝數與病例生存期之間的關聯關系。左：基于 WES 數據；右：基于 WGS 數據。
隨后，研究者又考查了致*基因局部擴增事件與賁門*預后之間的關系。CCNE1 的局部擴增與病人預后之間沒有**相關關系；EGFR 的局部擴增預示著較短的存活時長；而 ERBB2 的局部擴增則預示著較長的存活時長。
圖12. 不同致*基因局部擴增事件與賁門*預后之間的不同關系
研究者試圖將致*基因 ERBB2 對賁門*預后的影響精確到詳細的*癥分期，但因為測序研究的樣本量太小，不足以得出統計學上有說服力的結論。雖然缺乏大規模的賁門*測序研究的機會，但鄭州大學**附屬醫院自1973 年以來，收集了數以千計的賁門*樣本。研究者從 1668 份賁門*樣本進行了免疫組化實驗，檢驗其中是否存在 ERBB2 蛋白的表達。對于術后存活時長超過兩年的個案而言，免疫組化 ERBB2 陽性的患者的生存率要高于ERBB2 陰性的患者。研究者先前已經發現， ERBB2 的蛋白表達水平與 RNA 表達水平之間的皮爾森關聯系數高達0.79，具有很強的正相關關系。假若 ERBB2 的局部擴增可導致 ERBB2 蛋白的表達水平升高，那么 ERBB2 局部擴增或將可在臨床實踐中作為賁門*良好預后的一個生物標志物。有文獻報道，食道鱗*當中的 ERBB2 蛋白表達水平也與患者的生存率正相關，由此也暗示了賁門*與食道*之間的相似性。
圖13. 對于術后存活時長超過兩年的個案而言，免疫組化 ERBB2 陽性的患者的生存率要高于 ERBB2 陰性的患者。
小結
在這篇論文的研究中，作者們利用WGS數據確定了賁門*患者的局部擴增和ecDNA擴增子，并利用Circle-seq驗證了這些ecDNA擴增子。局部擴增現象存在于大多數賁門*患者中，并在不同的病例中表現出異質性。此外，有一些**基因在賁門*患者中以共擴增的形式存在。進一步，研究者發現，致*基因的局部擴增與染色體碎裂事件高度相關，而該研究所收集的病例當中如此高頻率的染色體碎裂事件的發生，很可能是由于當地飲食中過量攝入的亞硝胺損傷了DNA 雙鏈?；谝陨习l現，作者們推斷，如果對鄭州大學**附屬醫院所收集的大量的賁門*患者樣本進行環狀DNA 檢測，對于未來設計賁門***策略將是大有裨益的。近年來，由于實驗技術和生信分析技術的進步，環狀DNA相關研究發表 SCI 論文的數量呈井噴之勢增長。PubMed 搜索數據顯示，2017 年環狀DNA 相關論文全世界* 4 篇，后續幾年逐步增長為 6、7、10 篇，而到了現在的 2021 年，***個月，就已經有 15 篇 環狀DNA 相關論文見刊，其中還不乏 Nature、Cancer Cell 等高分期刊，環狀DNA已成為生命科學的**科研熱點之一。
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