搜索

取消

清空記錄

歷史記錄

清空記錄

歷史記錄

清空記錄

歷史記錄

網站標題

021-64878766

當前位置：

新聞中心

聯系我們

云序生物

021-64878766

market@cloud-seq.com.cn

上海市松江區莘磚公路518號24號樓4樓

項目文章|赫捷院士團隊揭密肺腺* m6A 機制再次登上Nature 子刊！

本期我們繼續為大家介紹赫捷院士團隊 2021 年 5 月 8 日在 Nature 旗下期刊 Cell Death & Disease（IF=9.685）上發表的題為 “WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis” 的肺腺* m6A機制文章

繼前面介紹中國醫學科學院**醫院赫捷院士團隊2021年6月21日在Nature Communications（IF=17.694）上發表“METTL3 promotes tumour developmentby decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding”的食管鱗* m6A機制文章后，本期我們繼續為大家介紹赫捷院士團隊 2021 年 5 月 8 日在 Nature 旗下期刊 Cell Death & Disease（IF=9.685）上發表的題為 “WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis” 的肺腺* m6A機制文章。該研究揭示了一種 Wnt/β-catenin 介導的 FTO 下調的關鍵機制，并凸顯了 MYC mRNA 的 m6A 修飾在調節**細胞糖酵解和生長中的作用。云序生物有幸參與了兩次研究當中的m6A MeRIP-seq和RNA-seq的測序服務以及生信分析。

發表期刊：Cell Death & Disease
發表日期：2021年5月8日
影響因子：9.685
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP、Co-IP 實驗等
文章鏈接：WNT/β-catenin-suppressed FTO expression increases m6A of c-Myc mRNA to promote tumor cell glycolysis and tumorigenesis

研究內容

一、FTO表達下調可促進肺腺*（Lung Adenocarcinoma）的生長和轉移，FTO 下調越嚴重，病患的生存率越低
作者首先從 TCGA 的公開數據中發現，肺腺*組織中的 FTO 表達水平低于鄰近的正常組織，然后對 FTO 的 mRNA 進行 qPCR 實驗，驗證了這種表達差異的存在。免疫組化染色實驗也證實 FTO 的的表達水平在肺腺*組織中要低于鄰近的正常組織。Kaplan-Meier 分析顯示，低 FTO 表達水平的病患擁有較低的總生存率。
在人類肺腺*細胞系中對 FTO 的 mRNA 的敲降實驗發現，FTO 表達的降低可**增強細胞的增殖以及非錨定依賴性生長（Anchorage-independed growth）的能力，細胞周期的速度也更快，細胞遷移和侵入性也更強。在體內實驗方面，若將 FTO 敲降的細胞系注入無胸腺裸鼠的尾靜脈內，相比于注入未敲降細胞的對照組，FTO 敲降的實驗組中的**細胞有明顯地向肺部轉移。
上述發現都指向一個結論：FTO 在肺腺*細胞中的下調促進了**的生長和轉移。

二、Wnt 信號通路提高了 FTO 啟動子區的組蛋白 H3K27me3 甲基化，從而抑制 FTO 的表達
肺腺*細胞中的 FTO 的表達是因為什么原因而下調的呢？為了回答這個問題，作者用 PROMO 軟件分析 FTO 基因的啟動子序列，在其中找到了 3 個有可能是 TBE 元件（LEF/TCF-binding element）的區域。為了驗證生信預測的真實性，作者又進行了了一系列分子生物學實驗。首先，ChIP 實驗證實了 TCF4 與 FTO 啟動子的結合。另外，熒光素酶報告基因的結果顯示，β-catenin 也可通過結合前述的 3 個 TBE 元件來抑制 FTO 啟動子。因此，β-catenin/LEF/TCF 復合體被證明可以抑制 FTO 啟動子的活性。人類肺腺*細胞系經過 Wnt 處理后，FTO 的 mRNA 和蛋白表達水平均有所降低，并且這種現象可通過敲降 β-catenin 來逆轉。綜合前面的幾個發現可以證明：Wnt 在信號通路的上游，通過誘導 β-catenin，使得β-catenin/LEF/TCF 復合體結合到 FTO 啟動子上，*終抑制了 FTO 的表達。
那么，Wnt 信號通路到底是怎么抑制 FTO 啟動子的呢？作者通過ChIP 實驗發現，FTO 基因啟動子區域的 TBE 元件區域附近的組蛋白存在 H3K27me3 的甲基化修飾現象。學界在先前的研究中已經知曉，EZH2 是一種負責組蛋白 H3K27me3 甲基化修飾的酶。通過Co-IP 實驗發現，Wnt 刺激可以促進 EZH2 與 β-catenin 的結合；通過 ChIP 實驗發現，Wnt 刺激也可以促進 EZH2 與 TBE 元件的結合。并且，敲降 EZH2 可阻斷 Wnt 對 FTO 表達的抑制作用。綜合前面的幾個發現可以證明：Wnt 信號誘導了 EZH2 與 β-catenin 的結合，導致了 FTO 啟動子附近的組蛋白發生 H3K27me3 甲基化修飾，從而抑制 FTO 表達。

三、FTO 表達下調可提高 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平，從而促進 c-Myc 的表達
在肺腺*細胞當中，哪些 RNA 會受 FTO 表達下調的調控，進而引發肺腺*呢？為了探明 FTO 下游的分子致病原因，作者進行了 m6A 甲基化測序，發現 FTO 敲降的肺腺*細胞當中有大量基因的 mRNA m6A 甲基化上調。FTO 是一種典型的 RNA m6A 甲基化的去修飾酶（也就是 m6A 的 “Eraser”），可以消去 m6A 甲基化，還原出普通的 A 堿基。通過云序生物m6A MeRIP-seq發現，FTO敲降細胞中有 556 個基因的 mRNA的 m6A 修飾水平升高；生信分析也發現，FTO 敲降細胞的代謝通路當中有許多基因的 mRNA 的 m6A 修飾水平升高，其中就包括一個重要的轉錄因子 MYC。m6A MeRIP-seq的結果可以驗證，當敲降了 FTO 之后，MYC 基因的 mRNA 的終止密碼子附近的 m6A 修飾水平升高。通過云序生物m6A MeRIP-qPCR 實驗結果也證實，FTO 的敲降可以提升 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。針對 FTO 蛋白的 RIP 實驗更是直接證明，FTO 結合在 MYC 的 mRNA 上面。綜合前面的幾個發現可以證明，FTO 可結合 MYC 的 mRNA，從而降低 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平。
那么，c-Myc 蛋白的表達水平又是如何受到調控的呢？作者設計了熒光素酶報告基因，將熒光素酶報告基因插入 MYC 的 mRNA 中，并將實驗組的 mRNA 3’ 端的 m6A 突變為其它堿基，對照組的 MYC mRNA 則不做任何堿基修飾。結果發現，FTO 敲降后，對照組的 MYC mRNA 表達了大量熒光素酶，但經過堿基突變而不再具有 m6A 的實驗組則沒有熒光素酶信號，說明 MYC 的 mRNA 3’ 端的 m6A 對于蛋白的成功翻譯不可或缺。相反地，如果過表達 FTO，那么肺腺*細胞系的 c-Myc 蛋白的表達量會下降。但是，無論是 FTO 敲降還是過表達，MYC 的 mRNA 水平都沒有改變。綜上可知，c-Myc 蛋白表達量的變化，與 MYC mRNA 的 m6A 修飾水平正相關，而與 MYC mRNA 的表達水平無關。

四、YTHDF1 通過結合 m6A 修飾的 MYC mRNA 來促進其翻譯
既然 FTO 敲降所導致的 c-Myc 蛋白的表達水平上升并不是由 MYC mRNA 表達水平的變化造成的，那么造成這一現象的原因會是什么呢？會不會是 mRNA 翻譯調控呢？YTHDF1 是一種典型的 RNA m6A 甲基化識別蛋白（也就是 m6A 的 “Reader”）。用 anti-YTHDF1 抗體進行RIP實驗，發現 FTO 的敲降將會增強 YTHDF1 與 MYC mRNA 的結合。雖然敲降 YTHDF1 并沒有影響 MYC mRNA 的表達水平，但卻能降低 c-Myc 蛋白的表達水平。在上一段中發現的 FTO 的敲降所導致的 c-Myc 蛋白表達水平的上升，還會被 YTHDF1 的敲降所逆轉，說明 YTHDF1 發揮功能的位置在 FTO 的下游和 c-Myc 的上游。綜上可知，FTO 表達下調所導致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾，可被 YTHDF1 識別并結合，從而促進 MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。

五、FTO 表達下調所誘導的 c-Myc 表達，可促進肺腺*細胞的糖酵解、生長、遷移、侵入和**發生
c-Myc 蛋白在*癥的代謝當中扮演重要的角色，因此作者就 c-Myc 的高表達在肺腺*當中所發揮的作用進行了進一步的研究。首先，在小鼠肺腺*細胞系中，FTO 敲降的細胞表現出己糖激酶-2（HK2） mRNA 和蛋白高表達的現象，說明 FTO 敲降細胞的糖酵解活躍。并且，FTO 敲降誘導的 HK-2 高表達現象，可被 c-Myc 敲降所逆轉，說明 c-Myc 發揮功能的位置在 FTO 的下游和己糖激酶的上游。類似地，FTO 敲降細胞的葡萄糖攝取、乳糖生成、細胞增殖、細胞遷移、細胞侵入能力等均有升高，且這些升高現象均可被 c-Myc 敲降所逆轉。
作者進一步進行了體內實驗：在無胸腺裸鼠體內，注入 FTO 敲降的肺腺*細胞系可以促進**生長，且該生長促進的現象可被 c-Myc 的敲降所逆轉。免疫組化染色實驗發現，在注入了 FTO 敲降細胞的**組織當中，c-Myc、HK-2 以及 Ki67（一種細胞增殖的標志物）均有高表達，且該現象可被 c-Myc 敲降所逆轉。此外，注入了 FTO 敲降細胞的裸鼠發生了**轉移，且這種轉移可被 c-Myc 敲降所抑制。綜合前面的幾個發現可以證明：FTO 表達下調所誘導的 c-Myc 表達，可在小鼠體內促進肺腺*的生長和轉移。

要點總結

在本研究當中，作者發現：

肺腺*組織當中，m6A 的去修飾化酶 FTO 的表達水平存在下調。
Wnt 信號誘導的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 復合體結合于 FTO 基因啟動子區域的 TBE 元件區域，通過組蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的轉錄。
通過m6A MeRIP-seq發現FTO 的表達下調使得包含 MYC 在內的多種代謝相關基因的 mRNA 的 m6A 修飾水平升高。
MYC mRNA 的 m6A 修飾可以募集 m6A 識別蛋白 YTHDF1 的結合，從而促進 c-Myc 蛋白的翻譯表達，進而提升**細胞的糖酵解水平和細胞增殖能力，促進**發生。

云序點評

本篇論文體現了從酶出發研究 RNA 的 m6A 修飾的一種經典研究思路。
首先，作者發現了肺腺*當中 m6A 去修飾化酶 FTO 的異常低表達，就此選定 FTO 這個酶為研究對象。緊接著，作者敲降 FTO 以控制變量，以研究 FTO 這個酶在肺腺*中所發揮的功能。下一步，作者從上游和下游兩個方向篩選出與 FTO 基因或 FTO蛋白發生互作的分子：一方面，通過一系列Co-IP、ChIP 和熒光素酶報告實驗，作者證明 FTO 基因是 Wnt 信號通路的靶基因，Wnt 誘導的 EZH2/β-catenin/LEF/TCF 復合體結合于 FTO 基因啟動子區域的 TBE 元件區域，通過組蛋白 H3K27me 的甲基化抑制了 FTO 基因的轉錄；另一方面，通過m6A MeRIP-seq 和生信預測，作者篩選出 MYC 作為 FTO 蛋白的靶基因，并通過一系列的MeRIP-qPCR、RIP 和熒光素酶報告實驗，證明 c-Myc 蛋白的表達量是跟隨 FTO 蛋白表達量變化的因變量。
在研究了 FTO 對肺腺*的作用機制的基礎上，作者還進一步探索了 m6A 識別蛋白 YTHDF1 在肺腺*中扮演的角色。首先，通過 RIP實驗，作者證明了 YTHDF1 與 MYC mRNA 的結合。隨后，通過結合 FTO 敲降和 YTHDF1 敲降實驗的結果，證明 FTO 表達下調所導致的 MYC mRNA 高水平 m6A 修飾，可被 YTHDF1 識別并結合，從而促進 MYC mRNA 翻譯為 c-Myc 蛋白。
在本研究當中，肺腺*致病機理當中的 “Eraser” 和 “Reader” 都得到了闡釋。這些新發現對于肺腺*的**提供了一種全新的潛在思路。

云序生物 m6A 修飾研究五大模塊

01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-meRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
mRNA測序
miRNA測序

02 檢測整體m6A RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

云序生物服務優勢

優勢一：發表10分以上文章*多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表53+篇高水平文章，合計影響因子460分+，是國內支持發文*多、累計影響因子**的公司。
優勢二：至今完成4000+例 m6A測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：**提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優勢五：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內*全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。

云序客戶 RNA 修飾部分文章列表

圖片9.png