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m6A項目文章|ALKBH5通過調控WNT5A穩定性促進缺血后血管生成
本期分享云序客戶上海中山醫院心內科葛均波院士課題組發表的“Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A”文章，運用MeRIP-seq和RNA-seq的方法探討了ALKBH5在缺血性血管生成中的作用，證明其通過m6A依賴的方式調控WNT5A mRNA轉錄后調節和穩定。
文章導讀
近年來研究表明缺血后血管生成是血流恢復和缺血組織修復的關鍵。N6 -甲基腺苷(m6A)在許多生物過程中起著重要作用，但m6A對缺血后血管生成的影響及相關機制尚不完全清楚。本期分享云序客戶上海中山醫院心內科葛均波院士課題組發表的“Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A”文章，運用MeRIP-seq和RNA-seq的方法探討了ALKBH5在缺血性血管生成中的作用，證明其通過m6A依賴的方式調控WNT5A mRNA轉錄后調節和穩定，該結果發現靶向ALKBH5可能是包括外周動脈疾病在內的缺血性疾病的潛在**選擇，為揭示m6A修飾在缺血性血管生成中發揮作用進行助力，從而為人們**外周動脈疾病在內的缺血性疾病提供了新的思路。
發表期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：7.919
研究方法：m6A meRIP-seq、RNA-seq、qPCR
文章鏈接：Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A
研究內容
（1）缺氧損害血管生成能力并在CMECs中上調ALKBH5的表達
為了闡明m6A在缺血后血管生成中的作用，作者檢測了缺氧損傷對CMECs血管生成表型的影響。CCK-8檢測顯示，CMECs活力在缺氧3 h后升高，12 h達到峰值，24 h后明顯下降(圖1A)。采用EdU檢測細胞增殖，缺氧24 h后EdU陽性細胞比例**降低(圖1B和1C)。劃痕和遷移試驗顯示缺氧**減少了愈合面積(圖1B和1D)和遷移CMECs的數量(圖1B和1E)且**損害了CMECs的血管形成能力(圖1B和1F)。綜上所述，缺氧24 h可抑制CMECs細胞增殖、遷移和血管生成。為了確定m6A是否參與了這一過程，進行了點印跡實驗發現m6A的豐度在缺氧的CMECs中**降低(圖1G)。RT-qPCR檢測了甲基化相關酶在缺氧CMECs中的mRNA表達水平的變化，發現甲基轉移酶WTAP和去甲基化酶ALKBH5在缺氧損傷后**上調(圖1H)。Western blot分析進一步證實在低氧CMECs中，ALKBH5表達**上調(圖1I和1J)。
（2）ALKBH5過表達加重了缺氧誘導的CMECs功能障礙
缺氧誘導的ALKBH5是否參與了血管生成？作者對ALKBH5過表達，并通過Western blot(圖2A)證實過表達效率。缺氧條件下ALKBH5過表達CMECs中m6A豐度降低(圖2B)。EdU和CCK-8測定結果表明缺氧條件下ALKBH5過表達抑制CMECS增殖(圖2C和2D)和細胞活力(圖2E)。Scratch和transwell檢測也顯示，在缺氧條件下過表達ALKBH5抑制CMECs的遷移能力(圖2F和2I)。此外，ALKBH5過表達在缺氧條件下破壞了血管的形成(圖2J和2K)。這些結果表明，雖然ALKBH5上調在常氧條件下可能不會**影響CMECS功能，但在缺氧條件下會嚴重加劇CMECS功能障礙，從而導致血管生成受損。
（3）ALKBH5下調可減輕缺氧誘導的CMECs功能障礙
為了進一步研究ALKBH5在血管生成中的作用，作者用siRNA敲除了ALKBH5(圖3A)。斑點雜交實表明，在常氧和缺氧條件下ALKBH5 KO中m6A整體水平**升高(圖3B)。EdU和CCK-8檢測顯示，在缺氧條件下ALKBH5 KO可以提高CMECs的增殖和活力(圖3C-3E)，增強CMECs的遷移(圖3F-3I)。同樣地，缺氧條件下ALKBH5 KO促進CMECs管的形成，而在常氧狀態下則沒有(圖3J和3K)。上述數據表明，ALKBH5 KO在緩解缺氧誘導的內皮血管生成損傷中起著關鍵作用。
（4） MeRIP-seq聯合RNA-seq揭示了ALKBH5的潛在靶基因
為探討缺氧條件下ALKBH5抑制內皮血管生成的機制，在缺氧條件下轉染對照或ALKBH5 siRNA后，將MeRIP-seq和RNA-seq聯合應用于CMECs中。MeRIP-seq共發現12783個共同峰，對照組特有477個峰ALKBH5-KO 有，2358個特有峰。此外，發現771個低甲基化峰和1072個高甲基化峰(圖4A)。MeRIP-seq進一步揭示了差異甲基化mRNA峰的分布特征(圖4B)和百分比(圖4C)?；谶@些數據對兩組CMECs進行了motif分析(圖4D)。富集基因的差異表達分析顯示1352個基因表達下調，2914個基因表達上調(圖4E)。結合MeRIP-seq分析，natriuretic，peptide C 和 FBXW5分別被鑒定為具有代表性的低甲基化和高甲基化基因(圖4F)。GO分析發現低甲基化基因主要參與細胞周期和RNA代謝等過程。而高甲基化基因主要富集在血管生成和細胞增殖調控中(圖4G)。這些結果進一步證實了ALKBH5 KO誘導m6A高甲基化增強血管生成。POSTAR 、血管生成數據庫、以及MeRIP-seq數據、RNA-seq數據結合鑒定了調控血管生成的ALKBH5靶基因。所得結果顯示SKP2、WNT5A和FGF18是有待進一步研究的潛在促血管生成ALKBH5靶基因(圖4H)。
（5）ALKBH5調控WNT5A mRNA的穩定性和衰減
MeRIP-seq數據顯示，ALKBH5敲除后SKP2、WNT5A和FGF18 mRNA的m6A豐度**增加(圖5A)。MeRIP-qPCR也對此結果進行了證實(圖5B)。為了進一步檢測m6A是否影響目的基因的表達，RT-qPCR和Western blot分析發現ALKBH5 KO增加了WNT5A表達(圖5C, 5D)。RT-qPCR與放線菌素D檢測不同時間點CMECs中WNT5A mRNA的穩定性和衰減，結果顯示添加放線菌素D后，WNT5A的表達量呈隨時間下降。然而，與對照組相比，ALKBH5敲除**延遲了WNT5A mRNA的降解，從而延長了其半衰期(圖5E)。為了進一步探討ALKBH5對WNT5A mRNA的調控作用，作者評估了在缺氧CMEC中ALKBH5過表達后的WNT5A mRNA表達和穩定性。結果發現，過表達ALKBH5**降低了WNT5A在蛋白和mRNA水平的表達(圖5F)，縮短了WNT5A mRNA的半衰期，降低了WNT5A mRNA的穩定性(圖5G)。通過RIP-qPCR實驗，發現ALKBH5與WNT5A mRNA結合(圖5H)。這些數據表明，ALKBH5通過去除轉錄后m6A修飾，促進WNT5A mRNA的衰變并降低其半衰期。是否ALKBH5介導的血管生成依賴于WNT5A？CCK-8和EdU檢測顯示Foxy-5**逆轉了ALKBH5過表達對CMECs增殖的抑制作用(圖5I、5J)。此外，Foxy-5**消除了過表達ALKBH5后對CMECs遷移的抑制(圖5K)。血管形成實驗證實Foxy-5恢復了ALKBH5過表達受損的CMECs細胞的血管形成能力(圖5L）。因此，WNT5A是ALKBH5的靶標mRNA。缺氧時ALKBH5通過破壞和衰變WNT5A mRNA，從而抑制血管生成能力。
（6）ALKBH5過表達減弱缺血損傷后的血流量恢復和血管生成
為了研究ALKBH5對缺氧時體內血管生成的影響，在小鼠后肢缺血前4周，通過在小鼠腓腸肌注射AAV獲得了ALKBH5的持續過表達。在后肢缺血前以及后肢缺血后21天內評估了ALKBH5過表達效率、m6A水平、血流速率和血管生成標志物的表達(圖6A)結果顯示，在注射過表達ALKBH5 AAV后，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白(圖6B)**上調。此外，過表達ALKBH5后，m6A豐度**降低(圖6C)。與對照組相比，在后肢缺血后第7-21天，過表達ALKBH5的小鼠血流恢復率明顯降低(圖6D和6E)。此外，與對照組相比，長期過表達ALKBH5的小鼠中CD31和α-SMA的表達水平也**下調(圖6F和6G)，它們分別表明****和小動脈的密度。因此，過表達ALKBH5會減弱血流恢復和缺血后血管生成。
（7）ALKBH5基因敲除和腺病毒抑制表達增加了血管生成，改善了缺血損傷后的血流恢復
作者采用體外血管萌發模型和體內后肢缺血模型來驗證ALKBH5的血管生成調節作用。點印跡實驗顯示，在ALKBH5 KO小鼠的主動脈環和腓腸肌組織中，m6A豐度**增加(圖7A、7C)。與同窩幼鼠相比，KO小鼠表現出更強勁的血管發育(圖7B)。同樣的，ALKBH5 KO小鼠后肢缺血后第7-21天血流恢復明顯增強(圖7 D)。此外，與WT小鼠相比，ALKBH5 KO小鼠腓腸肌中CD31和α-SMA的表達也**上調(圖7E)。這些結果表明，ALKBH5 KO對缺血后血管生成具有保護作用。作者通過腺病毒注射WT小鼠腓腸肌對ALKBH5進行了當即、后肢缺血7天和14天的短暫下調(圖7F)。腺病毒注射后1周、2周和3周，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白的表達均**降低(圖7G)。此外，在ALKBH5敲除后，點印跡實驗顯示腓腸肌m6A水平在缺血后3周**升高(圖7H)。在敲除ALKBH5后，缺血腓腸肌中CD31和-SMA的表達水平**升高(圖7I)。同時ALKBH5敲除小鼠血流恢復明顯改善(圖7j)?？傊?，這些結果闡明了ALKBH5在缺血后血管生成中的關鍵作用，并揭示了敲除或抑制ALKBH5表達的潛在優勢。未來的研究需要進一步驗證以促進臨床缺血損傷后的血管生成。
點評：文章通過m6A-meRIP-Seq結合全轉錄組測序技術（云序提供），通過對測序結果比對分析確認m6A甲基化修飾在缺氧后血管生成中起著重要作用。其中去甲基化酶ALKBH5以依賴于m6A修飾的方式調控WNT5A的表達，從而降低其穩定性，進而阻礙了缺氧CMECs中的血管生成。這些發現說明靶向ALKBH5可能成為包括外周動脈疾病在內的缺血性疾病的潛在**選擇。為促進缺氧損失后血管生成提供新的思路。
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-meRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
云序生物服務優勢
優勢一：發表10分以上文章*多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表47篇高水平文章，合計影響因子300分+，是國內支持發文*多、累計影響因子**的公司。
優勢二：至今完成4000+例 m6A測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：**提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down。
優勢五：率先研發超微量meRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內*全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
m1A RNA甲基化測序 m5C RNA甲基化測序 m7G （m3C）RNA 甲基化測序 2’-O-RNA氧化測序 ac4C乙?；瘻y序 o8G RNA氧化測序 比色法/LC-MS檢測整體m6A甲基化水平 RNA修飾相關酶PCR芯片 ATAC-seq ChIP-seq ATAC-seq
3-5月 m6A RNA甲基化影響因子10+文章集錦 云序客戶再發15分文章：FBW7靶向m6A結合蛋白YTHDF2抑制卵巢* Science新發現 |RNA以m6A依賴方式調節染色質狀態和基因轉錄 m6A 10分+文章思路干貨視頻 Nat Commun | 云序客戶揭示Mettl3協調**的生長和轉移的分子機制 項目文章|m6A甲基化修飾對神經退行性疾病的重大發現 云序客戶余健秀課題組m6A方向再次取得重大發現——SUMO化促進YTHDF2結合m6A修飾的mRNA影響**進展 一次RNA甲基化測序，多項成果|云序測序帶您超高性價比體驗 2020年整年度RNA甲基化文獻匯總 9-11月 m6A RNA甲基化影響因子10+文章集錦 m5C**高分匯總|帶你直擊m5C研究*前沿 云序用戶文章|Nature子刊揭示LncRNA發生m5C異常修飾或成肝*診斷新靶點 項目文章|Nature子刊m6A修飾攜手miRNA揭示脫氧膽酸在膽囊*中作用機制 云序超微量MeRIP測序技術助力用戶m6A甲基化文章連續發表 m1A多篇齊發：除了m6A，還有哪些熱門RNA修飾？ 云序客戶**成果揭秘：三個月內搞定5分m6A甲基化譜文章？ 云序4篇項目文章|m5C RNA修飾表達譜文章教您如何另辟蹊徑快速發文 ac4C榮登Nature：RNA修飾研究大有可為 8月m6A RNA甲基化影響因子10+文章集錦 20分Nature子刊|揭秘神經發育過程中m6A RNA甲基化與組蛋白修飾間的關系 去甲基化酶ALKBH5在胰腺*中的作用榮登15分雜志 國自然熱點—m6A等熱門RNA修飾研究技術漫談
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影響因子：7.919
研究方法：m6A meRIP-seq、RNA-seq、qPCR
文章鏈接：Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A
研究內容
（1）缺氧損害血管生成能力并在CMECs中上調ALKBH5的表達
為了闡明m6A在缺血后血管生成中的作用，作者檢測了缺氧損傷對CMECs血管生成表型的影響。CCK-8檢測顯示，CMECs活力在缺氧3 h后升高，12 h達到峰值，24 h后明顯下降(圖1A)。采用EdU檢測細胞增殖，缺氧24 h后EdU陽性細胞比例**降低(圖1B和1C)。劃痕和遷移試驗顯示缺氧**減少了愈合面積(圖1B和1D)和遷移CMECs的數量(圖1B和1E)且**損害了CMECs的血管形成能力(圖1B和1F)。綜上所述，缺氧24 h可抑制CMECs細胞增殖、遷移和血管生成。為了確定m6A是否參與了這一過程，進行了點印跡實驗發現m6A的豐度在缺氧的CMECs中**降低(圖1G)。RT-qPCR檢測了甲基化相關酶在缺氧CMECs中的mRNA表達水平的變化，發現甲基轉移酶WTAP和去甲基化酶ALKBH5在缺氧損傷后**上調(圖1H)。Western blot分析進一步證實在低氧CMECs中，ALKBH5表達**上調(圖1I和1J)。
（2）ALKBH5過表達加重了缺氧誘導的CMECs功能障礙
缺氧誘導的ALKBH5是否參與了血管生成？作者對ALKBH5過表達，并通過Western blot(圖2A)證實過表達效率。缺氧條件下ALKBH5過表達CMECs中m6A豐度降低(圖2B)。EdU和CCK-8測定結果表明缺氧條件下ALKBH5過表達抑制CMECS增殖(圖2C和2D)和細胞活力(圖2E)。Scratch和transwell檢測也顯示，在缺氧條件下過表達ALKBH5抑制CMECs的遷移能力(圖2F和2I)。此外，ALKBH5過表達在缺氧條件下破壞了血管的形成(圖2J和2K)。這些結果表明，雖然ALKBH5上調在常氧條件下可能不會**影響CMECS功能，但在缺氧條件下會嚴重加劇CMECS功能障礙，從而導致血管生成受損。
（3）ALKBH5下調可減輕缺氧誘導的CMECs功能障礙
為了進一步研究ALKBH5在血管生成中的作用，作者用siRNA敲除了ALKBH5(圖3A)。斑點雜交實表明，在常氧和缺氧條件下ALKBH5 KO中m6A整體水平**升高(圖3B)。EdU和CCK-8檢測顯示，在缺氧條件下ALKBH5 KO可以提高CMECs的增殖和活力(圖3C-3E)，增強CMECs的遷移(圖3F-3I)。同樣地，缺氧條件下ALKBH5 KO促進CMECs管的形成，而在常氧狀態下則沒有(圖3J和3K)。上述數據表明，ALKBH5 KO在緩解缺氧誘導的內皮血管生成損傷中起著關鍵作用。
（4） MeRIP-seq聯合RNA-seq揭示了ALKBH5的潛在靶基因
為探討缺氧條件下ALKBH5抑制內皮血管生成的機制，在缺氧條件下轉染對照或ALKBH5 siRNA后，將MeRIP-seq和RNA-seq聯合應用于CMECs中。MeRIP-seq共發現12783個共同峰，對照組特有477個峰ALKBH5-KO 有，2358個特有峰。此外，發現771個低甲基化峰和1072個高甲基化峰(圖4A)。MeRIP-seq進一步揭示了差異甲基化mRNA峰的分布特征(圖4B)和百分比(圖4C)?；谶@些數據對兩組CMECs進行了motif分析(圖4D)。富集基因的差異表達分析顯示1352個基因表達下調，2914個基因表達上調(圖4E)。結合MeRIP-seq分析，natriuretic，peptide C 和 FBXW5分別被鑒定為具有代表性的低甲基化和高甲基化基因(圖4F)。GO分析發現低甲基化基因主要參與細胞周期和RNA代謝等過程。而高甲基化基因主要富集在血管生成和細胞增殖調控中(圖4G)。這些結果進一步證實了ALKBH5 KO誘導m6A高甲基化增強血管生成。POSTAR 、血管生成數據庫、以及MeRIP-seq數據、RNA-seq數據結合鑒定了調控血管生成的ALKBH5靶基因。所得結果顯示SKP2、WNT5A和FGF18是有待進一步研究的潛在促血管生成ALKBH5靶基因(圖4H)。
（5）ALKBH5調控WNT5A mRNA的穩定性和衰減
MeRIP-seq數據顯示，ALKBH5敲除后SKP2、WNT5A和FGF18 mRNA的m6A豐度**增加(圖5A)。MeRIP-qPCR也對此結果進行了證實(圖5B)。為了進一步檢測m6A是否影響目的基因的表達，RT-qPCR和Western blot分析發現ALKBH5 KO增加了WNT5A表達(圖5C, 5D)。RT-qPCR與放線菌素D檢測不同時間點CMECs中WNT5A mRNA的穩定性和衰減，結果顯示添加放線菌素D后，WNT5A的表達量呈隨時間下降。然而，與對照組相比，ALKBH5敲除**延遲了WNT5A mRNA的降解，從而延長了其半衰期(圖5E)。為了進一步探討ALKBH5對WNT5A mRNA的調控作用，作者評估了在缺氧CMEC中ALKBH5過表達后的WNT5A mRNA表達和穩定性。結果發現，過表達ALKBH5**降低了WNT5A在蛋白和mRNA水平的表達(圖5F)，縮短了WNT5A mRNA的半衰期，降低了WNT5A mRNA的穩定性(圖5G)。通過RIP-qPCR實驗，發現ALKBH5與WNT5A mRNA結合(圖5H)。這些數據表明，ALKBH5通過去除轉錄后m6A修飾，促進WNT5A mRNA的衰變并降低其半衰期。是否ALKBH5介導的血管生成依賴于WNT5A？CCK-8和EdU檢測顯示Foxy-5**逆轉了ALKBH5過表達對CMECs增殖的抑制作用(圖5I、5J)。此外，Foxy-5**消除了過表達ALKBH5后對CMECs遷移的抑制(圖5K)。血管形成實驗證實Foxy-5恢復了ALKBH5過表達受損的CMECs細胞的血管形成能力(圖5L）。因此，WNT5A是ALKBH5的靶標mRNA。缺氧時ALKBH5通過破壞和衰變WNT5A mRNA，從而抑制血管生成能力。
（6）ALKBH5過表達減弱缺血損傷后的血流量恢復和血管生成
為了研究ALKBH5對缺氧時體內血管生成的影響，在小鼠后肢缺血前4周，通過在小鼠腓腸肌注射AAV獲得了ALKBH5的持續過表達。在后肢缺血前以及后肢缺血后21天內評估了ALKBH5過表達效率、m6A水平、血流速率和血管生成標志物的表達(圖6A)結果顯示，在注射過表達ALKBH5 AAV后，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白(圖6B)**上調。此外，過表達ALKBH5后，m6A豐度**降低(圖6C)。與對照組相比，在后肢缺血后第7-21天，過表達ALKBH5的小鼠血流恢復率明顯降低(圖6D和6E)。此外，與對照組相比，長期過表達ALKBH5的小鼠中CD31和α-SMA的表達水平也**下調(圖6F和6G)，它們分別表明****和小動脈的密度。因此，過表達ALKBH5會減弱血流恢復和缺血后血管生成。
（7）ALKBH5基因敲除和腺病毒抑制表達增加了血管生成，改善了缺血損傷后的血流恢復
作者采用體外血管萌發模型和體內后肢缺血模型來驗證ALKBH5的血管生成調節作用。點印跡實驗顯示，在ALKBH5 KO小鼠的主動脈環和腓腸肌組織中，m6A豐度**增加(圖7A、7C)。與同窩幼鼠相比，KO小鼠表現出更強勁的血管發育(圖7B)。同樣的，ALKBH5 KO小鼠后肢缺血后第7-21天血流恢復明顯增強(圖7 D)。此外，與WT小鼠相比，ALKBH5 KO小鼠腓腸肌中CD31和α-SMA的表達也**上調(圖7E)。這些結果表明，ALKBH5 KO對缺血后血管生成具有保護作用。作者通過腺病毒注射WT小鼠腓腸肌對ALKBH5進行了當即、后肢缺血7天和14天的短暫下調(圖7F)。腺病毒注射后1周、2周和3周，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白的表達均**降低(圖7G)。此外，在ALKBH5敲除后，點印跡實驗顯示腓腸肌m6A水平在缺血后3周**升高(圖7H)。在敲除ALKBH5后，缺血腓腸肌中CD31和-SMA的表達水平**升高(圖7I)。同時ALKBH5敲除小鼠血流恢復明顯改善(圖7j)?？傊?，這些結果闡明了ALKBH5在缺血后血管生成中的關鍵作用，并揭示了敲除或抑制ALKBH5表達的潛在優勢。未來的研究需要進一步驗證以促進臨床缺血損傷后的血管生成。
點評：文章通過m6A-meRIP-Seq結合全轉錄組測序技術（云序提供），通過對測序結果比對分析確認m6A甲基化修飾在缺氧后血管生成中起著重要作用。其中去甲基化酶ALKBH5以依賴于m6A修飾的方式調控WNT5A的表達，從而降低其穩定性，進而阻礙了缺氧CMECs中的血管生成。這些發現說明靶向ALKBH5可能成為包括外周動脈疾病在內的缺血性疾病的潛在**選擇。為促進缺氧損失后血管生成提供新的思路。
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-meRIP-seq）
對m6A RNA甲基化，目前***的檢測手段為m6A-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
- m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
- m6A LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
- m6A Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
- m6A mRNA測序
- m6A miRNA測序
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法檢測整體RNA修飾水平
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。
云序生物服務優勢
優勢一：發表10分以上文章*多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表47篇高水平文章，合計影響因子300分+，是國內支持發文*多、累計影響因子**的公司。
優勢二：至今完成4000+例 m6A測序樣本，**覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三：**檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優勢四：**提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down。
優勢五：率先研發超微量meRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢六：國內*全的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
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