2021年3月2日,云序客戶空軍軍醫大學張瑞以及楊安鋼共同通訊在Nature Communications 上在線發表題為”RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming”的研究論文,該研究運用云序生物m6A-meRIP-seq的方法發現骨髓細胞中Mettl3的敲除可促進體內**的生長和轉移,并闡明了該過程的分子機理。該結果為尋找**免疫**靶點提供了一個新的方向。
發表期刊:Nature Communications
影響因子:17.694
研究方法:m6A- meRIP-seq、meRIP-qPCR等
文章鏈接:RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming
研究內容
(1)骨髓特異性的Mettl3缺失促進**生長和轉移。
為了研究m6A修飾在巨噬細胞中的作用,作者將WT BMDMs(骨髓源性巨噬細胞)與B16細胞共孵育,發現Mettl3的表達明顯減少。為了研究骨髓細胞中的Mettl3是否能夠調節**的進程。作者將Mettl3fl/fl小鼠與Lyz-cre小鼠雜交敲除了髓腔室中的Mettl3。然后,對Mettl3fl/flLyz2+/+ (WT)和Mettl3fl/flLyz2cre/+ (KO)小鼠的BMDMs和腹腔巨噬細胞(PMs)進行qRT-PCR和western blotting檢測。結果表明,來自KO小鼠的BMDMs和BM中Mettl3 mRNA表達分別下降了約75%和80%。此外,KO BMDMs中mRNA上m6A修飾水平低于WT。作者將B16或LLC細胞皮下注射到WT或KO小鼠中,KO小鼠的**生長速度明顯快于WT小鼠,這些敲除Mettl3小鼠的生存時間縮短(圖1a-d)。通過尾靜脈將B16或LLC細胞注射到小鼠體內,生物發光成像顯示,與WT小鼠相比,KO小鼠的肺轉移增強(圖1e, f)。組織學檢查顯示,與WT小鼠相比,KO小鼠有更大、更多的肺轉移結節且Ki67染色增加(圖1g-j),導致KO小鼠比WT小鼠總生存時間縮短(圖1k)。此外,與正常組織中的巨噬細胞相比,TAMs中Mettl3的表達減弱(圖1 l)。上述結果說明Mettl3在骨髓細胞中的缺失會導致**的生長和增殖。
為了探討BMDMs中Mettl3的缺失是否會促進**生長,作者建立了巨噬細胞和**細胞的混合模型。用CFSE標記BMDMs,并將B16或LLC細胞共注入小鼠皮下F4/80免疫熒光染色結果顯示CFSE標記的細胞共注射BMDMs可在**中存活2周。進一步的分析表明,B16或LLC細胞與KO BMDMs共注射可加速**的生長(圖2a-f)。接下來,在實驗前兩天通過靜脈注射氯膦酸脂質體來減少小鼠的巨噬細胞,然后將B16細胞靜脈注射到小鼠體內,生物發光成像顯示,巨噬細胞耗竭消除了WT和KO小鼠**生長和轉移的差異(圖2g, h),并通過肺**組織學分析證實了這一點(圖2i, j)。消耗了巨噬細胞的小鼠的生存期得到延長,用氯膦酸脂質體處理的WT和KO小鼠之間沒有明顯差異(圖2k)。綜上所述,巨噬細胞中METTL3在促進**進展中發揮重要作用。
(2)巨噬細胞中Mettl3的缺失通過增強M1-和M2-like TAM和Treg對**的浸潤來重塑**微環境。
為了評估Mettl3對免疫微環境的影響,采用流式細胞術對脾和肺進行免疫表型分型,發現KO小鼠的M1巨噬細胞, M2巨噬細胞和調節性T細胞的總體百分比增加。為了進一步研究Mettl3對**微環境的影響,通過單細胞RNA測序分析了WT或KO小鼠**中的CD45+細胞。KO小鼠的**與WT小鼠的**在免疫細胞的組成上存在差異,包括TAMs、MDSCs和CD4+的數量增加,T細胞以及粒細胞和CD8+ T細胞數量減少的趨勢。此外,通過流式細胞術對含有mettl3-缺陷巨噬細胞的**組織進行免疫表型分析,發現M1-和M2-like TAMs總體百分比增加(圖3a)。此外,MDSCs和調節性T細胞的數量有增加的趨勢(圖3b-d)。先前的研究表明,Treg在各種**組織中的遷移和浸潤似乎依賴于**細胞或浸潤巨噬細胞產生的CCR4配體(CCL22)的表達。通過qRT-PCR和ELISA檢測發現,在mettl3缺失的BMDMs和TAMs中,CCL22表達明顯上調(圖3e, f)。作者研究了注射抗CD25抗體對Treg水平的影響,發現Treg水平有75%的下降。隨著Treg細胞數量的減少,Th1細胞和IFN-γ+ CD8 T細胞在**細胞中增加,而Th2細胞基本未受影響。進一步分析表明WT和接受抗CD25抗Treg消除抗體的KO小鼠在**生長或轉移方面沒有明顯差異,但與WT小鼠相比,在未處理組,KO小鼠的**生長增加(圖3g-k)。去掉Treg后,WT和KO小鼠的存活率差異也消失了(圖3l)。這些數據表明髓系細胞中Mettl3的缺失促進了**的生長和轉移,其方式依賴于M1/M2-like TAM浸潤和Treg募集。
(3)Mettl3敲除通過NF-kB / STAT3軸促進BMDMs中M1和M2極化。
為了研究Mettl3在巨噬細胞極化中的潛在作用,使用LPS和IFN-γ誘導M1巨噬細胞或IL-4誘導M2巨噬細胞。qRT-PCR檢測了M1和M2巨噬細胞相關基因的表達,發現在mettl3缺失的BMDMs中TNF-α、IL-6和Arg1的表達明顯上調(圖4a)。ELISA還發現Mettl3缺失的BMDMs中TNF-α和IL-6表達上調,IL-10表達相對不變(圖4 b)。在Mettl3缺失的BMDMs中也觀察到精氨酸酶活性的增加(圖4c)。在BMDMs中評估了p65,觀察到p65和STAT3磷酸化水平在mettl3缺失的巨噬細胞中升高(圖4d)。NF-κB的抑制降低了TNF-α、IL-6和Arg1,而抑制STAT3通路降低了WT和KO BMDMs中Arg1的表達(圖4 e)。芯片分析表明p-STAT3特異性結合到Arg1的啟動子上(圖4f)。接下來從攜帶**的小鼠中收獲并用流式細胞術檢測TAMs結果顯示,KO TAMs中M1和M2巨噬細胞相關基因表達同時增加,這與p65和STAT3磷酸化和ARG1表達增強有關(圖4g-i)。綜上所述,這些數據表明Mettl3的缺失導致NF-κB通路和STAT3信號通路的**,從而導致M1和M2-like巨噬細胞極化。
(4)**細胞增強細胞因子的產生,并在mettl3敲降巨噬細胞中**NF-κB和STAT3。
由于NF-κB和STAT3可受細胞外源性因子TNF-α或IL-6刺激BMDMs調節。免疫印跡結果顯示,KO BMDMs誘導p-p65和p-STAT3的能力比WT更明顯。qRT-PCR分析顯示TNF-α處理后TNF-α和IL-6的表達增加,通過bay11-7082阻斷NF-κB通路后逆轉,而IL-6作用后,Arg1的表達增加,通過STAT3抑制劑S3I-201處理后逆轉。這些結果提示,NF-κB/IL-6/STAT3信號軸在KO BMDMs中比WT BMDMs更活躍。
為了評估NF-κB/IL-6/STAT3信號軸在**微環境中的作用,將B16或LLC細胞與BMDMs孵育,發現IL-6在B16和LLC細胞中表達上調,p65磷酸化水平增加,并通過bay11 -7082阻斷NF-κB通路后逆轉(圖5a)。進一步發現TNF-α**不僅增加了p65的磷酸化也增加IL-6的表達,用NF -κB抑制劑處理可逆轉**細胞中IL-6的表達(圖5b)。此外,WT或KO BMDMs用bay11 -7082或抗TNF-α抗體前處理然后與B16或LLC細胞共培養。qRT-PCR分析顯示,bbay11 -7082或抗TNF-α抗體的加入抑制了IL-6的表達(圖5c),伴隨p65和STAT3磷酸化降低(圖5 d)。此外,在mettl3缺失的BMDMs與B16或LLC細胞共培養時,與WT BMDMs相比,Arg1的表達明顯降低(圖5e, f)??傊?,這些數據表明,mettl3缺失的巨噬細胞通過調節細胞因子反應重塑了**微環境。
(5)METTL3的缺失會損害YTHDF1介導的SPRED2翻譯。
探討m6A在巨噬細胞重編程中的作用,對WT和KO BMDMs進行了m6A meRIP-seq,生信分析得到了m6A峰密度圖(圖6a),Motif分析發現了m6A修飾的保守Motif“GGAC”(圖6b)。為確定m6a調控的巨噬細胞極化潛在的目標基因,作者在MAPK通路相關基因和70個m6A下調基因中取交集獲得候選基因。在這些基因中,Spred2上m6A水平明顯降低(圖6c, d)。此外,meRIP-qPCR 證實Spred2是m6A調控的靶基因(圖6e)。隨后在KO BMDMs和TAMs中發現,SPRED2蛋白表達降低,而mRNA水平沒有明顯改變(圖6f)。mRNA衰減實驗表明,m6A修飾對Spred2的衰減沒有明顯影響(圖6g)。因此推測在Mettl3缺失的BMDMs中,SPRED2蛋白表達的下調可能是由于YTHDF1控制的蛋白質翻譯效率的差異所致。
然后作者通過多聚體分析WT和KO BMDMs將RNA分成非翻譯部分,翻譯起始部分和翻譯活性多聚體(圖6h)。qRT-PCR結果顯示,mettl3缺失的BMDMs翻譯活性多聚體中Spred2 mRNA水平明顯低于WT BMDMs(圖6i)。然后檢測了METTL3是否被招募到Spred2啟動子中并影響Spred2的表達,結果表明野生型METTL3 和催化死亡突變體METTL3可影響熒光素酶活性。為了研究CDS中m6A甲基化是否能調控SPRED2的表達,將m6A修飾保守位點GGAC突變為GCTC (SPRED2 -CDS mut1或SPRED2 -CDS mut2)或同時突變(SPRED2 -CDS mut1/2)。其中Spred2-CDS mut2和Spred2-CDS mut1/2降低了SPRED2水平而Spred2-CDS mut1沒有,這表明Spred2-CDS mut2中的m6A基序是表達調控的主要位點(圖6j, k)。此外,RNA-IP結果顯示,YTHDF1和Spred2在Mettl3 KO植株中互作下降。為了證實YTHDF1在m6a調控SPRED2表達中的作用,在BMDMs中下調了YTHDF1的表達。YTHDF1基因敲除明顯減弱SPRED2在BMDMs中的表達,增加了ERK, NF-κB和STAT3磷酸化。qRT-PCR分析顯示,YTHDF1敲除后Tnf-α、Il-6、Arg1和Ccl22的表達增加。此外,BMDMs中SPRED2的下調導致ERK、NF-κB和STAT3磷酸化上調,并伴有Tnf-α, Il-6, Arg1和Ccl22上調表達??偟膩碚f,BMDMs中Mettl3的丟失導致BMDMs中ythdf1介導的SPRED2的翻譯和ERK, NF-κB和STAT3磷酸化。
(6)髓系細胞中Mettl3的缺失會損害PD-1阻斷**B16黑色素瘤的療效。
為了評估靶向METTL3**抗**反應的潛力,在B16**轉移模型中測試了抗PD-1**。正如預期的那樣發現在KO小鼠中,B16**對抗pd -1**的反應較低,這增加了**生長和肺轉移,縮短了生存時間(圖7a-f)。說明Mettl3缺乏的髓系細胞參與了B16**對抗PD-1**產生耐藥性。
總結
這篇文章結合m6A meRIP-seq、 meRIP-qPCR等實驗手段探究了甲基轉移酶METTL3的髓樣特異性缺失對小鼠**的生長和轉移的影響,揭示了Mettl3確實可通過影響巨噬細胞重編程增強小鼠**模型中的**生長和轉移,并減弱PD-1阻斷療法。該研究表明巨噬細胞中的m6A甲基化酶是潛在的****靶標,為靶向****提供了新的思路。
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序(m6A-seq)
對m6A RNA甲基化,目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術,適用于m6A RNA甲基化譜研究,快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序:
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m6A 全轉錄組測序(涵蓋mRNA,LncRNA,circRNA)
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m6A LncRNA測序(涵蓋LncRNA和mRNA)
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m6A Pri-miRNA測序(涵蓋Pri-miRNA和mRNA)
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m6A mRNA測序
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m6A miRNA測序
02 檢測整體m6A RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
**高效,可以實現一次檢測,9類修飾水平檢測,一步到位。
比色法
快速檢測m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗證
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務,可針對mRNA,lncRNA,環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測,低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
05機制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點,研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白,研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作,研究相應的分子調控機制。
云序生物服務優勢
優勢一:發表10分以上文章***多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表42篇高水平文章,合計影響因子300分+,是國內支持發文多、累計影響因子高的公司。
優勢二:至今完成4000+例 m6A測序樣本,覆蓋醫口、農口等各類樣本。
優勢三:檢測mRNA和各類非編碼RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
優勢四:提供m6A一站式服務:m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down。
優勢五:率先研發超微量MeRIP測序,RNA量低至500ng起。
優勢六:國內***全的RNA修飾測序平臺,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙?;?'-O-甲基化測序。
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