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項目文章|m6A甲基化修飾對神經退行性疾病的重大發現
近年來，人們發現表觀遺傳上的修飾與多種疾病的發**展密切相關。其中m6A修飾作為RNA修飾中常見的修飾，在神經系統中的研究也備受關注。近期云序客戶在Environmental Pollution期刊上發表了“Global N6-methyladenosine profiling of cobalt-exposed cortex and human neuroblastoma H4 cells presents epitranscriptomics alterations in neurodegenerative disease-associated genes”文章。
近年來，人們發現表觀遺傳上的修飾與多種疾病的發**展密切相關。其中m6A修飾作為RNA修飾中常見的修飾，在神經系統中的研究也備受關注。近期云序客戶在Environmental Pollution期刊上發表了“Global N6-methyladenosine profiling of cobalt-exposed cortex and human neuroblastoma H4 cells presents epitranscriptomics alterations in neurodegenerative disease-associated genes”文章，運用云序生物的m6A-MeRIP-seq和RNA-seq的技術闡明了CoCl2處理會**改變涉及突觸傳遞和****發育通路的基因的m6A修飾和表達的變化。該結果為m6A修飾在環境中神經毒物引起的神經退行性損傷中的作用提供了新的見解，從而拓寬了人們對重金屬誘導RNA的表觀遺傳調控機制的理解。
發表期刊：Environmental Pollution
影響因子：9.988
研究方法：m6A- meRIP-seq、RNA-seq、qPCR
文章鏈接：Global N6-methyladenosine profiling of cobalt-exposed cortex and human neuroblastoma H4 cells presents epitranscriptomics alterations in neurodegenerative disease-associated genes
（1）CoCl2引起神經系統的病理和神經行為損傷
為了鑒定CoCl2會造成什么病理損傷，作者采用H&E染色法、Bielschowsky銀染和Nissl染色法檢測發現暴露于CoCl2后，皮質細胞數量**減少，神經纖維纏結的數量增加，Nissl體減少。為進一步鑒定CoCl2對神經系統的影響，作者通過在小鼠中進行Morris water maze評估發現隨著時間的增長，小鼠在CoCl2中逃跑的潛伏期逐漸縮短。此外，中、高劑量CoCl2組小鼠在目標象限停留的時間更少，通過平臺的次數也明顯低于對照組。根據到達平臺所需的距離和到達次數間接反映小鼠的空間學習記憶能力，根據軌道圖可知神經行為損傷的小鼠到達平臺的距離較長，到達平臺的次數較少。綜上可知，長時間暴露于CoCl2中會導致空間學習和記憶障礙。
（2）GO和KEGG分析大腦皮層中受CoCl2影響的差異表達基因
通過RNA-seq發現在CoCl2中有339個基因表達水平發生了變化，其中188個基因表達上調，有151個基因表達下調。KEGG通路分析發現差異上調基因主要富集于睡眠、視黃醇代謝、藥物代謝等方面；差異下調基因主要與代謝通路相關。GO分析表明，上調表達的基因在****系統發育、神經發生、氧結合等方面豐富；下調基因主要富集于多種代謝途徑。
（3）CoCl2導致了大腦皮層基因m6A修飾的改變
m6A 比色法 鑒定m6A修飾總體水平發現，與對照組相比暴露于CoCl2的小鼠皮質內的總RNA的m6A修飾水平**降低。使用m6A-MeRIP-seq顯示，與對照組相比CoCl2處理組中有4048個基因的m6A修飾發生改變，其中2446個基因m6A修飾增加，1602個基因m6A修飾減少。GO和KEGG通路分析用于鑒定差異甲基化基因，高甲基化基因主要參與胞吞、剪接、信號轉導、突觸傳遞、RNA轉運等通路而低甲基化基因主要富集于谷氨酸能、多巴胺能和GABA突觸相關性。此外有48個基因既發生m6A修飾又受CoCl2調控，這些基因參與了神經元發育、細胞增殖和遷移途徑。進一步觀察發現CoCl2處理后有730個基因與神經退行性疾病相關，其中418個基因m6A修飾增加，312個基因的m6A修飾減少。
（4）CoCl2誘導大腦皮層中m6A修飾和基因表達變化機制
為了研究CoCl2處理如何改變m6A修飾并影響了基因表達。作者通過WB和qRT-PCR檢測了去甲基酶(FTO和ALKBH5)和甲基轉移酶(METTLL3、METTL14和WTAP)分別在處理組和對照組表達，結果發現FTO和ALKBH5蛋白和mRNA在處理組的表達水平增加，而METTL3、METTL14和WTAP蛋白和mRNA表達水平降低。這些發現表明，CoCl2調控m6A甲基轉移酶和去甲基化酶的表達水平，從而改變了m6A修飾和基因表達。
（5）H4細胞中m6A峰的差異分布
作者在H4細胞中進行了m6A-MeRIP-seq，首先分析了所有m6A的motif分布，結果顯示對照組中有17290個的共有峰和9349個特異的m6A峰，在處理組中有14339個共有峰和9075獨特的m6A峰。根據6個細胞樣本中m6A峰的轉錄組分布，90%以上的峰位于基因區(5 ' -UTR、CDS、3 ' -UTR、內含子、停止密碼子)，不到20%的峰位于基因區（5 ' -UTR區和3 '-UTR區），60%以上的峰位于CDS區。同時，超過23%的富集m6A峰包含GGACG序列。此外，m6A-MeRIP-seq數據中與對照組相比，共有8752個基因甲基化，其中3835個基因發生高甲基化，而4917個基因發生低甲基化。
（6）GO和KEGG通路分析CoCl2處理H4細胞后表達變化的基因的富集情況
利用RNA-seq在H4細胞中尋找CoCl2調控的基因，有218個基因在CoCl2處理后出現，其中205個基因下調，13個基因上調。通過GO分析，差異基因主要富集于金屬離子結合等方面；KEGG通路分析發現，差異表達基因在MAPK、HIF、**代謝以及凋亡、增殖和氧化相關通路中富集。進一步分析發現，有172個既發生了表達變化又有m6A修飾改變，167個高m6A修飾基因表達下調，5個低m6A修飾基因表達上調。對m6A修飾的氧化應激相關基因qRT-PCR分析結果顯示PDK1、EGLN1、HO-1和VHL的表達在兩組間有**性差異。
（7）CoCl2改變了m6A的甲基轉移酶和去甲基化酶從而調節RNA m6A甲基化
對H4細胞進行不同濃度的CoCl2(100、400和600 mM)處理。用WB和qRT-PCR檢測去甲基化酶(FTO和ALKBH5）和甲基轉移酶(METTLL3, METTL14, WTAP)。結果證實CoCl2組中FTO、ALKBH5、METTL3、METTL14的表達水平下降，而WTAP蛋白表達水平升高。接下來，進一步驗證CoCl2是否會抑制m6A去甲基酶活性，作者用m6A去甲基化酶**/抑制測定試劑盒檢測了CoCl2對m6A去甲基酶活性的影響。細胞暴露于不同的CoCl2 24h后，m6A去甲基化酶活性呈濃度依賴性下降。這些結果表明，CoCl2不僅調節m6A甲基化酶和去甲基化酶的表達，也降低了m6A去甲基化酶的活性，從而導致m6A甲基化改變。
文章通過m6A-meRIP-Seq結合全轉錄組測序技術（云序提供），通過對測序結果比對分析確認m6A甲基化修飾在CoCl2介導的神經毒性中起著重要作用，文中結合這兩個測序結果取交集縮小差異范圍，明確檢測目標。另外MeRIP-qPCR結合WB實驗（云序提供），驗證CoCl2處理可以降低m6A修飾酶和去甲基化酶的表達以改變受m6A甲基化調控的基因表達，從而導致一系列的生物學不良反應。這些發現不僅有助于我們更好地了解疾病的病因，而且為重金屬的**模式提供了新的靶點。
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-seq）
對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：
02 檢測整體m6A RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
準確高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
meRIP-qPCR
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
優勢一：發表10分以上文章多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表36篇高水平文章，合計影響因子232分，是國內支持發文多、累計影響因子高的公司。
優勢二：檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA, Pri-miRNA等）。
優勢三：提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優勢四：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢五： 國內RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
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發表期刊：Environmental Pollution
影響因子：9.988
研究方法：m6A- meRIP-seq、RNA-seq、qPCR
文章鏈接：Global N6-methyladenosine profiling of cobalt-exposed cortex and human neuroblastoma H4 cells presents epitranscriptomics alterations in neurodegenerative disease-associated genes
（1）CoCl2引起神經系統的病理和神經行為損傷
為了鑒定CoCl2會造成什么病理損傷，作者采用H&E染色法、Bielschowsky銀染和Nissl染色法檢測發現暴露于CoCl2后，皮質細胞數量**減少，神經纖維纏結的數量增加，Nissl體減少。為進一步鑒定CoCl2對神經系統的影響，作者通過在小鼠中進行Morris water maze評估發現隨著時間的增長，小鼠在CoCl2中逃跑的潛伏期逐漸縮短。此外，中、高劑量CoCl2組小鼠在目標象限停留的時間更少，通過平臺的次數也明顯低于對照組。根據到達平臺所需的距離和到達次數間接反映小鼠的空間學習記憶能力，根據軌道圖可知神經行為損傷的小鼠到達平臺的距離較長，到達平臺的次數較少。綜上可知，長時間暴露于CoCl2中會導致空間學習和記憶障礙。
（2）GO和KEGG分析大腦皮層中受CoCl2影響的差異表達基因
通過RNA-seq發現在CoCl2中有339個基因表達水平發生了變化，其中188個基因表達上調，有151個基因表達下調。KEGG通路分析發現差異上調基因主要富集于睡眠、視黃醇代謝、藥物代謝等方面；差異下調基因主要與代謝通路相關。GO分析表明，上調表達的基因在****系統發育、神經發生、氧結合等方面豐富；下調基因主要富集于多種代謝途徑。
（3）CoCl2導致了大腦皮層基因m6A修飾的改變
m6A 比色法 鑒定m6A修飾總體水平發現，與對照組相比暴露于CoCl2的小鼠皮質內的總RNA的m6A修飾水平**降低。使用m6A-MeRIP-seq顯示，與對照組相比CoCl2處理組中有4048個基因的m6A修飾發生改變，其中2446個基因m6A修飾增加，1602個基因m6A修飾減少。GO和KEGG通路分析用于鑒定差異甲基化基因，高甲基化基因主要參與胞吞、剪接、信號轉導、突觸傳遞、RNA轉運等通路而低甲基化基因主要富集于谷氨酸能、多巴胺能和GABA突觸相關性。此外有48個基因既發生m6A修飾又受CoCl2調控，這些基因參與了神經元發育、細胞增殖和遷移途徑。進一步觀察發現CoCl2處理后有730個基因與神經退行性疾病相關，其中418個基因m6A修飾增加，312個基因的m6A修飾減少。
（4）CoCl2誘導大腦皮層中m6A修飾和基因表達變化機制
為了研究CoCl2處理如何改變m6A修飾并影響了基因表達。作者通過WB和qRT-PCR檢測了去甲基酶(FTO和ALKBH5)和甲基轉移酶(METTLL3、METTL14和WTAP)分別在處理組和對照組表達，結果發現FTO和ALKBH5蛋白和mRNA在處理組的表達水平增加，而METTL3、METTL14和WTAP蛋白和mRNA表達水平降低。這些發現表明，CoCl2調控m6A甲基轉移酶和去甲基化酶的表達水平，從而改變了m6A修飾和基因表達。
（5）H4細胞中m6A峰的差異分布
作者在H4細胞中進行了m6A-MeRIP-seq，首先分析了所有m6A的motif分布，結果顯示對照組中有17290個的共有峰和9349個特異的m6A峰，在處理組中有14339個共有峰和9075獨特的m6A峰。根據6個細胞樣本中m6A峰的轉錄組分布，90%以上的峰位于基因區(5 ' -UTR、CDS、3 ' -UTR、內含子、停止密碼子)，不到20%的峰位于基因區（5 ' -UTR區和3 '-UTR區），60%以上的峰位于CDS區。同時，超過23%的富集m6A峰包含GGACG序列。此外，m6A-MeRIP-seq數據中與對照組相比，共有8752個基因甲基化，其中3835個基因發生高甲基化，而4917個基因發生低甲基化。
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（7）CoCl2改變了m6A的甲基轉移酶和去甲基化酶從而調節RNA m6A甲基化
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文章通過m6A-meRIP-Seq結合全轉錄組測序技術（云序提供），通過對測序結果比對分析確認m6A甲基化修飾在CoCl2介導的神經毒性中起著重要作用，文中結合這兩個測序結果取交集縮小差異范圍，明確檢測目標。另外MeRIP-qPCR結合WB實驗（云序提供），驗證CoCl2處理可以降低m6A修飾酶和去甲基化酶的表達以改變受m6A甲基化調控的基因表達，從而導致一系列的生物學不良反應。這些發現不僅有助于我們更好地了解疾病的病因，而且為重金屬的**模式提供了新的靶點。
云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測序
m6A RNA修飾測序（m6A-seq）
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- m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
- m6A LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）
- m6A Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
- m6A mRNA測序
- m6A miRNA測序
02 檢測整體m6A RNA修飾水平
LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平
準確高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。
比色法
快速檢測m6A整體甲基化水平
m6A RNA修飾相關酶PCR芯片
尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。
meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同類型的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。
5.3 雙熒光素酶實驗
驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。
優勢一：發表10分以上文章多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。云序已累計支持客戶發表36篇高水平文章，合計影響因子232分，是國內支持發文多、累計影響因子高的公司。
優勢二：檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA, Pri-miRNA等）。
優勢三：提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down等。
優勢四：率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。
優勢五： 國內RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、ac4C乙?；?'-O-甲基化測序。
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