環狀RNA結合功能蛋白！找對方向20分文章水到渠成

環狀RNA作為研究持續火熱的明星分子，不同于對其豐富的表達譜研究，環狀RNA功能機制研究還**處在起步階段。環狀RNA研究多為miRNA海綿機制，部分circRNA可競爭性結合miRNA，解除miRNA對靶基因的抑 制作用，上調靶基因的表達。其實，環狀RNA可以通過結合不同種類的功能蛋白，分別在轉錄前、后及翻譯水平嚴格調控細胞生殖生長等過程。云序曾對環狀RNA經典研究思路進行過詳細解析(2018國自然研究熱點—環狀RNA研究深度剖析)，感興趣的老師可以查詢瀏覽。4月3日，**免疫學雜志Immunity(IF：22.845)在線發表了中科院生物物理所范祖森教授與王碩研究員為共同通訊作者的文章，介紹發現環狀RNA Cia-cGAS定位于細胞核，可結合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑 制其活性，調控長效造血干細胞(LT-HSC)靜息狀態。本文極大拓展了核內環狀RNA通過結合激酶發揮重要生理功能的研究思路。

研究背景：

造血干細胞(HSC)自我更新和分化之間的平衡打破將導致骨髓衰竭及惡性血液腫 瘤發生。然而，HSCs如何維持其靜止狀態并避免I型干擾素(IFN)介導能量耗竭、細胞凋亡仍未可知。本文一種名為cia-cGAS的環狀RNA，它在長效(LT)-HSCs細胞核中高度表達。小鼠Cia-cGAS缺陷將導致I型IFN在骨髓中高表達并伴隨靜息LT-HSC數量明顯減少。在穩態條件下，cia-cGAS在細胞核中通過結合DNA傳感器cGAS以阻斷其合酶活性，由此保護靜息LT-HSC免于被cGAS介導耗盡凋亡。此外，cia-cGAS與線性cGAS相比，與cGAS結合親和力更強，由此抑 制cGAS介導LT-HSCs中I型IFN產生。本文揭示了一個新型環狀RNA——cia-cGAS可結合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑 制其活性，調控長效造血干細胞(LT-HSC)靜息狀態。

研究思路：

本文首先基于高通量手段比較了小鼠中LT-HSC，ST-HSC和MPPs中全轉錄組變化，共發現156種明顯差異表達的circRNAs。表達量驗證證實9個circRNA在LT-HSC中明顯上調。在細胞表型層面，發現只有干擾D430042O09Rik轉錄的circRNA——Cia-cGAS后，可明顯改變造血干細胞的亞群分布，作者因此錨定Cia-cGAS進行機制分析。作者通過Cas-9基因敲除策略成功構建了Cia-cGAS基因敲除小鼠，在Cia-cGAS基因敲除小鼠中LT-HSC明顯減少，I型IFN表達升高。通過RNA Pull-down實驗，作者發現Cia-cGAS可以與cGAS結合，cGAS-RIP實驗反向證實二者之間具有直接的相互作用。后續，作者通過生信預測結合EMSA實驗分析了Cia-cGAS與cGAS相互作用的位點信息。酶學研究證明，Cia-cGAS可通過結合cGAS并抑 制其活性。

研究一：環狀RNA分子篩選及驗證

為探索造血干細胞功能相關的circRNA分子，作者比較了小鼠不同造血干細胞(LT-HSC，ST-HSC和MPPs)中全轉錄組變化情況，找出了156種明顯差異表達的circRNA分子，其中49種在LT-HSC中高表達。RNase R及qPCR實驗證實其中9種為真實LT-HSC中高表達環狀RNA 分子。為有效篩選造血干細胞相關的circRNA分子，作者通過體內circRNA干擾實驗，發現只有干擾Cia-cGAS后才能明顯影響小鼠體內造血干細胞亞群分布，并表現為LSK祖細胞數量明顯增加，與此同時LT-HSC細胞數量明顯減少。因此，作者結合轉錄組數據以及體內、體外驗證實驗，錨定Cia-cGAS分子進行后續分子機制研究。

研究二：環狀RNA分子細胞表型

作者發現Cia-cGAS是由D430042O09Rik (chr7: 125776974–125784712)的4、5、6號外顯子連接成環。且位于外顯子上下游的內含子區域具有成環所需高度同源序列。作者通過Cas9技術手段，敲除一端同源序列后，成功獲得Cia-cGAS敲除小鼠模型。敲除小鼠中LSK祖細胞明顯增多，LT-HSC明顯減少，且基因敲除小鼠出生6個月后會死于貧血。對基因敲除小鼠中LT-HSC進行BrdU染色，結果說明敲除小鼠中LT-HSC細胞處于增殖分裂活躍期。同時脈沖標記H2B-GFP小鼠模型證實Cia-cGAS敲除后，靜息狀態的LT-HSC細胞比例明顯降低。

研究三：環狀RNA分子功能機制

在確定Cia-cGAS具有明顯細胞表型之后，作者圍繞其分子機制展開了詳細的探索。為了找到Cia-cGAS影響下游的靶基因，作者在敲除Cia-cGAS后進行轉錄組分析，發現差異表達的基因與IFN-α下游靶基因是一致的。且當Cia-cGAS敲除后I型IFN mRNAs 表達量也明顯增高。作者證實cia-cGAS通過調控I型IFN通路影響LT-HSC靜息狀態。接下來，作者針對Cia-cGAS在該通路中的作用機理進行了詳細解析。作者直接采用RNA Pull Down技術手段找到與Cia-cGAS相互作用的功能蛋白?；谶@一技術手段，作者發現Cia-cGAS與cGAS蛋白具有明顯相互作用。cGAS RIP實驗反向證實二者之間具有真實的相互作用。免疫熒光及FISH實驗證實Cia-cGAS及cGAS細胞內共定位表達?；贓MSA等技術手段，作者找到了二者相互作用位點。后續作者補充大量生理生化實驗，揭示LT-HSC中Cia-cGAS結合并抑 制cGAS的活性，通過拮抗cGAS催化產物I型IFN來維持HSCs靜息狀態。

總結：

本文從環狀RNA結合功能蛋白角度，成功的向我們展示了核內circRNA具有重要生理功能，以及該類型circRNA的研究方法。首先通過高通量測序篩選與造血干細胞干性維持相關的circRNA分子，圍繞該分子設計一系列體內、體外干擾實驗，確定其可引起干細胞干性維持相關細胞表型改變。后續，與circRNA 海綿機制研究類似，RNA Pull Down實驗及RIP實驗成為機制研究成功與否的關鍵鑰匙。作者基于RNA Pull-down技術篩選到可能與Cia-cGAS相互作用的蛋白質，并進一步通過RIP實驗反向驗證。在補充大量生理生化實驗后，作者向我們完整的描繪了Cia-cGAS如何維持HSCs靜息狀態。本文給我們提供了很好的范本，當我們篩選到的環狀RNA定位于核內，或者不能與AGO2蛋白結合，不適合進行海綿機制研究時，我們可采取的研究策略。

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作者簡介：

范祖森，二級研究員，現任中科院感 染與免疫重點實驗室副主任，國科大微免教研室副主任，中國科學院特聘核**骨干研究員,國科大崗位教授(A類)。范祖森1998年獲上海交通大學醫學院免疫學博士學位，隨后到哈佛大學醫學院從事博士后研究，于2003年晉升為哈佛大學講師。2004年作為中國科學院“百人計劃”研究員回到生物物理所工作，2005年獲“杰出青年”基金資助，2010年享受“***特殊津貼”專家。2014年獲得談家楨生命科學創新獎，2016年評為中科院研究生導師。課題組長期從事天然免疫抗感 染應答調控、腫 瘤干細胞和腫 瘤免疫治 療等研究，在天然免疫細胞新亞群發現、天然免疫抗感 染識別機制、腫 瘤干細胞自我更新機制等方面，取得了一系列有國際影響力的原創性成果。以第**及通訊作者在Cell(2篇)、Nat Immunol(5篇)、Immunity(2篇)、Cell Stem Cell(2篇)、JEM(3篇)、JCI、NSMB、Nat Commun(8篇)、 EMBO J(2篇)、Blood等國際**學術期刊發表SCI高水平研究論文70余篇，研究處于國際前沿。課題組經過多年的研究積累業已形成免疫學研究平臺和優良的科研文化氛圍，在天然免疫抗感 染應答與腫 瘤免疫領域培養出科研團隊。已培養了30余位博士畢業生和近10位博士后，10余人獲得中科院院長特別獎博士論文，有近10人晉升為教授崗位(包括北大、清華教授)，3人獲得中組部“青年千人”計劃，1人獲得基金委“優青”等。

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