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            云序客戶成果|circRNA有望成為食管鱗ai的分子標志物
            環狀RNA作為新發現的RNA分子，從誕生之日起就是光環加身，屢屢登上Science、Nature、Cell等高 分期刊。近期發表的《2019研究前沿》中，“環狀RNA作為ai癥新的生物標志物”成為生物科學領域6個新興前沿之一。2019年環狀RNA共發表SCI論文885篇，較2018年增長約20%，其中大于10分的文章約60篇，是2018年的3倍左右。2019年關于環狀RNA的國自然審批金額高達8000多萬，環狀RNA的火熱仍在持續。
            環狀RNA作為新發現的RNA分子，從誕生之日起就是光環加身，屢屢登上Science、Nature、Cell等高 分期刊。近期發表的《2019研究前沿》中，“環狀RNA作為ai癥新的生物標志物”成為生物科學領域6個新興前沿之一。2019年環狀RNA共發表SCI論文885篇，較2018年增長約20%，其中大于10分的文章約60篇，是2018年的3倍左右。2019年關于環狀RNA的國自然審批金額高達8000多萬，環狀RNA的火熱仍在持續。
             環狀RNA 
	
            

            文章摘要
            

            近期，云序客戶汕頭大學醫學院附屬第二醫院在Epigenomics雜志（IF 4.4）上發表了關于環狀RNA/circRNA對食管鱗ai影響的文章。目前，關于circRNAs在食管鱗狀細胞ai(ESCC)中的作用尚不清楚。本文中作者在食管鱗狀細胞ai手術前后患者的6對血漿樣品進行circRNA測序（云序提供）并用qPCR反應驗證了20對組織和105對血漿樣品中環狀RNA的差異表達。發現hsa_circ_0004771表達上調，且與腫 瘤負擔重、預后差等臨床指標相關，它的表達下調對食管ai細胞增殖有抑 制作用。機制上，hsa_circ_0004771作為miR-339-5p的分子海綿正向調節CDC25A，挽救實驗證實了這種調控關系。暗示hsa_circ_0004771可作為一種侵襲性較小的通用生物標志物，對腫 瘤的診斷和預后判斷有一定價值。下面小編和大家一起解讀這篇文章。 
             環狀RNA 

            

             環狀RNA 
	
            

            原文鏈接：CircRNA hsa_circ_0004771 promotes esophageal squamous cell cancer progression via miR-339-5p/CDC25A axis
            

            發表期刊：Epigenomics
            影響因子：4.4
            發表日期：20200213
            運用技術：circRNA測序 、circRNA-PCR（本實驗由云序提供）
            實驗材料：食管鱗狀細胞ai手術前后患者的血漿樣品 6 vs 6
            文章內容
            1.全轉錄組測序篩選食管鱗狀細胞ai中差異表達的環狀
            作者首先對食管鱗狀細胞ai手術前后患者的血漿樣品（6:6）使用circRNA測序（本實驗由云序提供），并對circRNA表達譜進行了分析。發現，切除腫 瘤后circRNA有5個上調，18個下調（log2 (fold change) ≥1.5, p < 0.05）。根據23種circRNA的表達進行的層次聚類分析表明，樣品的術前或術后狀態準確地將其分為兩個簇（圖1B）。其中，術前樣本中編號20的被錯誤地分配到了術后組，這可能是因為該患者的腫 瘤處于早期階段。
            接著作者通過qPCR分別在7對手術前后ESCC患者血漿、 20對ai與ai旁組織以及105對ESCC患者和健康血漿中對差異表達的環狀進行了circRNA-PCR驗證（本實驗由云序提供），發現hsa _circ_0000437和hsa_circ_0004771的表達變化與RNA-Seq結果一致。ROC曲線分析顯示，hsa_circ_0004771的曲線下面積比hsa_circ_0000437大，選擇hsa_circ_0004771作進一步分析，因為它具有更高的意義和更好的診斷價值。生存曲線分析也證實，hsa_circ_0004771的高表達與不良預后相關，表明hsa_circ_0004771可作為預后指標。綜上表明，hsa_circ_0004771具有臨床生物標志物的價值。
             hsa circ 0004771被鑒定為有價值的臨床生物標志物 

            

             圖1 hsa circ 0004771被鑒定為有價值的臨床生物標志物
            
             
	
            

            2.hsa_circ_0004771結構和功能鑒定
            為了證明hsa_circ_0004771的環狀結構，作者分別進行了Sanger測序、反向引物驗證、RNase R耐受等試驗（以上實驗云序均提供），證明hsa_circ_0004771確實是環狀結構。
            接著作者開始探究hsa_circ_0004771的功能，敲除hsa_circ_0004771后，分別在體內外進行了CCK-8試驗、克隆形成和Transwell試驗的實驗，發現敲除hsa_circ_0004771能夠顯 著抑 制ESCC細胞的增殖、侵襲和遷移。
            hsa_circ_0004771結構和功能鑒定  

            

             圖2 hsa_circ_0004771結構和功能鑒定 
	
            

            3.hsa_circ_0004771吸附 miR-339-5p發揮功能
            為了確定hsa_circ_0004771調控的ESCC細胞增殖的機制，作者分析了細胞周期的變化。敲除hsa_circ_0004771后，細胞群體顯示出G1期細胞百分比增加，而S期細胞百分比降低，表明hsa_circ_0004771的下游靶點可能是細胞周期調節因子。FISH分析表明，hsa_circ_0004771主要位于細胞質中，這表明其生物學功能是轉錄后調控。綜上，hsa_circ_0004771通過促進細胞周期進程表現出增殖特性，并且主要位于細胞質中。
            接著作者進行了Ago2-RIP實驗（云序可提供），發現hsa_circ_0004771可以結合Ago2蛋白。前人研究表明，hsa_circ_0004771分別在乳腺ai和胃ai中能夠吸附miR-653 、miR-339-5p 和miR-149-5p。作者預測了hsa_circ_0004771的潛在miRNA結合位點和下游靶基因。其中miR-339-5p已證實可參與調節多種ai基因的表達，可抑 制許多人類腫 瘤中的細胞遷移和侵襲。尤其值得注意的是，ESCC組織中miR-339-5p差異表達，并且其表達與ESCC的預后呈負相關。綜上所述，作者認為hsa_circ_0004771可以吸附miR-339-5p。
            于是作者進行了進一步驗證，首先在ESCC細胞中敲除hsa_circ_0004771后，miR-339-5p的表達水平顯 著上調。然后預測了miR-339-5p和hsa_circ_0004771的潛在結合位點后，作者突變了hsa_circ_0004771序列的miR-339-5p目標位點（突變位點顯示為紅色）后，進行雙熒光素酶實驗，證實了兩者之間的相互結合。此外，作者還對兩者的表達關系進行了研究，發現ESCC腫 瘤組織中miR-339-5p與hsa circ 0004771表達呈負相關。綜上所述，這些證據表明，hsa_circ_0004771可充當miR-339-5p的海綿。
            hsa_circ_0004771可吸附 miR-339-5p  

            

             圖3 hsa_circ_0004771可吸附 miR-339-5p 
	
            

            4.hsa_circ_0004771通過激 活CDC25A信號傳導發揮致ai作用
            作者進一步探索了hsa_circ_0004771 / miR-339-5p軸的下游機制。已有文獻報道miR-339-5p可以與CDC25A的3'UTR結合并抑 制CDC25A / CDK2途徑以介導局部晚期ESCC的放射敏感性。為了確定CDC25A是否是hsa_circ_0004771 / miR-339-5p軸的直接靶標，作者首先確認了在shRNA-hsa_circ_0004771處理ESCC細胞株后，CDC25A的mRNA和蛋白水平，發現兩者都呈現下調趨勢。接著作者又對兩者間的表達關系進行了進一步分析，發現兩者呈正相關。接著作者又進行了雙熒光素酶實驗（云序可提供），證明了CDC25A與miR-339-5p之間的結合。作者進行了回補實驗，發現過表達CDC25A能夠改善hsa_circ_0004771沉默后導致的ESCC細胞表型的改變?？偟膩碚f，這些結果表明CDC25A是hsa_circ_0004771 / miR-339-5p軸的功能靶標，并且hsa_circ_00047711通過激 活CDC25A途徑促進ESCC細胞增殖。
            CDC25A是hsa_circ_0004771 / miR-339-5p軸的功能靶標  

            

             圖4 CDC25A是hsa_circ_0004771 / miR-339-5p軸的功能靶標
            
             
	
            

            總結：
            ai癥是目前人類面臨重大的疾病。了解和探究腫 瘤生成機制，將會揭示重要的 腫 瘤發生 發展生物學過程，進而為臨床提供新的治 療方向和靶點。本文作者以ESCC為研究對象，通過circRNA測序和RIP-seq等技術研究了hsa_circ_0004771在ESCC形成中的作用。作者發現hsa_circ_0004771在ESCC患者的血漿和組織中均上調，其這種差異表達與不良預后相關。hsa_circ_0004771沉默可在體外和體內抑 制ESCC細胞增殖。該研究結果還表明，hsa_circ_0004771/ miR-339-5p / CDC25A信號傳導途徑可能與ESCC的腫 瘤發生有關。更重要的是，結合先前有關其他惡性腫 瘤的報道，當前的研究表明，hsa_circ_0004771可以作為一般的浸潤性較小的腫 瘤生物標志物，值得在將來進行更詳細的研究。
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