肝臟病學**雜志Hepatology (IF=14.97)在線發表了一項研究成果：RNA甲基化在NAFLD發生 發展中起著重要的作用。該文當中m6A-seq和RNA-seq由云序生物提供技術服務。據悉，復旦大學附屬中山醫院內分泌科團隊長期致力于NAFLD的發病機制研究，在近期工作中系統性闡明了多個與肝臟代謝相關的分子機制（PNAS 2019、Diabetes 2018、 Diabetes 2017、Cell Metabolism 2016、JCI 2014、Gut 2014）。本期我們解析該課題組2019年10月應用云序生物的RNA-seq技術服務，發表在PNAS雜志（IF 12.779）上關于內質網應激對2型糖尿病影響的文章。
2型糖尿病的發病機制主要是胰島素抵抗（IR）和胰島β細胞功能受損，已有研究提出內質網應激（ERS）是導致糖尿病、IR和肥胖發生的主要途徑。內質網應激是指由于某種原因使細胞內質網生理功能發生紊亂的一種亞細胞病理狀態。多種因素可以打破內質網的穩態，導致蛋白質折疊障礙或錯誤折疊，進而觸發內質網應激。適度的內質網應激會導致適應性的細胞保護作用，過高和持久的內質網應激則會激 活特有的凋亡通路導致細胞凋亡。內質網應激通過影響胰島細胞的功能，促使胰島β細胞凋亡及參與胰島素抵抗介導2型糖尿病的發生和發展。該研究顯示了內質網應激誘導的葡萄糖穩態破壞的機制，并提出USP14作為針對T2DM的潛在治 療靶標。
發表期刊：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.發表時間：2019.10.22實驗方法：RNA-seq（本實驗由云序提供）文獻鏈接：Sustained ER stress promotes hyperglycemia by increasing glucagon action through the deubiquitinating enzyme USP14 文章內容（1）持續的內質網應激破壞瘦小鼠的葡萄糖穩態為了確定持續的內質網應激對葡萄糖代謝的影響，研究人員通過小劑量衣霉素（LD-Tun）將瘦小鼠的慢性低度內質網應激誘導至與高脂飲食（HFD）喂養的肥胖小鼠相似的水平，發現低度內質網應激伴隨著高 血糖癥、葡萄糖耐受不良和**耐受不良（圖1 A、B和C）。另外，LD-Tun處理后，肝葡萄糖生成的標志物PEPCK和G6Pase的表達顯 著升高， LD-Tun也上調了PGC-1α基因，該基因可共同激 活糖異生轉錄因子（圖1D）。但是，胰島素敏感性、胰島素刺激的AKT磷酸化以及空腹和餐后血漿胰島素水平相對不受LD-Tun的影響（圖1E和F）。體內研究結果也發現，LD-Tun增加了小鼠原代肝細胞（MPHs）中的葡萄糖生成并上調了糖異生基因（圖1 G和H）。綜上所述，肥胖與慢性低度內質網應激相關，其通過破壞葡萄糖穩態增加肝糖原異生并導致高 血糖癥。
圖1. 持續的內質網應激會誘發高 血糖癥和肝糖異生
（2）USP14介導持續的內質網應激的糖原生成作用為了闡明持續的內質網應激對葡萄糖代謝的影響機制，作者通過RNA-seq（本實驗由云序提供），比較了鹽水和LD-Tun處理的肝臟組織。發現相對于對照小鼠，LD-Tun處理的小鼠肝臟中有超過1,131個基因表達發生了改變，其中792個上調基因和339個下調基因（FC＞1.5，P＜0.05），其中USP14表達改變顯 著。近期的研究表明，USP14可以調節肝甘油三酸酯的代謝。此外，USP14先前已被確定為IRE1α的結合伴侶，因此是UPR的潛在介體。因此，作者假設USP14在內質網應激相關糖異生中起作用。與假設一致，在接受LD-Tun治 療的小鼠肝臟中USP14明顯上調（圖2 A和B）。在LD-Tun處理的MPH中也觀察到USP14的上調（圖2 C和D）?；瘜W伴侶蛋白?；侨パ跄懰幔═UDCA）對內質網應激的緩解大 大減弱了LD-Tun誘導的USP14在MPHs中的表達（圖2 E和F）。這些數據證明內質網應激的激 活導致USP14的差異表達。為了確定USP14的高表達在持續內質網應激調節葡萄糖代謝中是必不可少的，作者敲除了瘦小鼠中的內源性USP14（圖2 G和H），發現LD-Tun對葡萄糖穩態和糖異生的影響減弱（圖2 I–L）。綜上表明，USP14介導持續內質網應激的糖原異生作用。
圖2. 持續內質網應激的糖原異生作用需要USP14
（3）持續的內質網應激通過ATF4上調USP14接下來，作者探究USP14是否是持續內質網應激的分子靶標。先前已證明ATF4是內質網應激通路的下游效應器，可觸發細胞凋亡。作者在MPH中過表達ATF4后，發現USP14表達上調（圖3 A和B）。突變ATF4后，減弱了LD-Tun誘導的USP14水平（圖3 C和D）。在敲除肝ATF4基因的小鼠中，分離MPH后也觀察到了相似的結果（圖3 E和F）。螢光素酶報告基因檢測表明，ATF4的過表達上調了USP14啟動子的轉錄活性，并確定了ATF4與USP14啟動子區域的直接結合。綜上所述，這些發現表明持續的內質網應激可通過ATF4上調USP14。
圖3. 持續的內質網應激通過ATF4上調USP14
（4）USP14刺激肝糖異生和葡萄糖輸出為了確定USP14是否足以改變肝糖代謝，作者向瘦小鼠體內注射野生型USP14（Ad-WT USP14）或其催化失活形式（Ad-CI USP14）的腺病毒（圖4A）。與感 染Ad-GFP和Ad-CI USP1的小鼠相比，過表達Ad-WT USP14后，顯 著增加了小鼠的血糖水平（圖4B）。另外，感 染Ad-WT USP14的小鼠葡萄糖耐受較差，肝葡萄糖輸出增強（圖4C和D）。同樣的，在過表達WT USP14的小鼠中也誘導了糖異生基因（圖4E）。在過表達Ad-WT USP14的MPH中也觀察到了葡萄糖生成和糖異生基因表達的增強（圖4 F和G）。因此，USP14對肝糖代謝有直接影響。
圖4. 肝USP14的過表達引起高 血糖癥并促進糖異生
（5）抑 制肝臟USP14可改善肥胖小鼠的葡萄糖代謝前期研究表明肥胖與低度內質網應激有關，因此USP14成了控制肥胖相關高 血糖的潛在靶標。作者用IU1（USP14的抑 制劑）治 療高脂飲食（HFD）喂養的肥胖小鼠，14天后發現血糖水平降低以及糖耐受得到改善，并且肝葡萄糖和糖原異生基因的表達顯 著下降。敲除USP14后，獲得了相似的結果（圖5 A–D）。瘦素缺乏的小鼠肝USP14的消耗也改善了葡萄糖的體內穩態，并減少了糖異生（圖5 E–H）。綜上所述，USP14可以成功地改善肥胖小鼠的葡萄糖穩態。
圖5. 抑 制肝臟USP14可改善肥胖小鼠的葡萄糖代謝
（6）USP14通過提高胰高 血糖素作用來增加肝糖異生
為了確定USP14的作用機制，作者分析了其對胰高 血糖素和胰島素的作用，胰高 血糖素和胰島素分別在禁食和進食狀態下維持葡萄糖穩態。在糖尿病小鼠中，敲除肝臟中USP14基因后，顯 著減輕了高 血糖癥并下調了糖原異生基因。這些結果表明，胰島素可能不介導USP14對糖異生的調節。相反，胰高 血糖素耐受性測試表明，在過表達USP14的小鼠中注射胰高 血糖素后，血糖水平明顯升高（圖6A）。此外，MPH中的USP14過表達和敲低分別增強和降低了胰高 血糖素刺激的葡萄糖生成（圖6 B和C），以及糖原異生基因的表達（圖6 D和E）。接下來作者檢查持續的內質網應激是否也以USP14依賴性方式增強了胰高 血糖素的作用。胰高 血糖素耐受性測試顯示，與對照小鼠相比，LD Tun處理的小鼠的胰高 血糖素刺激的血糖水平更高（圖6F）。同樣，LD-Tun顯 著增加了胰高 血糖素刺激的葡萄糖生成，并且這一現象可通過敲除USP14減弱（圖6G）。綜上，USP14通過增強胰高 血糖素的作用來促進糖異生和肝糖生成。
圖6. USP14通過提高胰高 血糖素作用來增加肝糖異生
（7）USP14提高CBP穩定性USP14的催化功能對其糖異生作用至關重要，這一事實表明，USP14可以通過穩定后者的靶蛋白來促進胰高 血糖素的作用。前期研究表明，循環系統中的胰高 血糖素會增加細胞內cAMP的水平，從而觸發cAMP依賴性蛋白激酶A磷酸化肝細胞中的CREB蛋白。CREB蛋白與糖異生基因CRE的啟動子區域結合，并通過募集2種共激 活因子（CRTC2和CBP）來激 活它的轉錄。作者推測USP14也是通過上述方式發揮作用，于是過表達USP14，發現肝臟和MPH中的CBP水平顯 著增加（圖7A和B），但沒有影響CREB和CRTC2的水平（圖7A）。與相應的對照小鼠相比，經LD-Tun治 療的小鼠和肥胖小鼠的肝臟中CBP水平也顯 著提高（圖7C-E）。敲除USP14后，這些小鼠中CBP蛋白質表達水平顯 著降低（圖7 F–H）。但是，CBP的mRNA水平沒有受到影響（圖7I），表明USP14在翻譯后水平上調節CBP的穩定性。 同樣，在過表達USP14或經LD-Tu處理的MPH中，CBP的半衰期增加了（圖7J和K），而敲低USP14則加速了CBP的降解（圖7L）。此外，MPH和小鼠肝臟中的共免疫沉淀法證實了USP14和CBP之間存在直接的相互作用（圖7 M和N）。為了測試這種相互作用是否可以抑 制CBP泛素化，將Flag標記的CBP，His標記的泛素和血凝素標記的CI USP14或WT USP14質粒共轉染到HEK293T細胞中。結果發現CBP泛素化增多，而共表達WT USP14可顯 著抑 制泛素與CBP的結合（圖7 O）。相反，內源性USP14的敲除顯 著增強了MPHs中內源性CBP的多聚泛素化作用（圖7 P）。此外，LD-Tun治 療減少了MPHs中CBP的泛素化（圖7Q， lane 2 vs. lane 1）。相反，即使在存在LD-Tun的情況下，內源性USP14表達的敲除也顯 著增加了CBP的泛素化（圖7Q，lane 3 vs. lane 2），而USP14的過表達則可以逆轉這種現象（圖7 Q，lane 4 vs. lane 3）。綜上，USP14是LD-Tun誘導的CBP去泛素化所必需的?？偟膩碚f，這些數據表明USP14結合CBP并阻止其泛素介導的降解，從而提高CBP穩定性。
圖7. USP14提高CBP穩定性
文章總結總體來說，作者通過RNA-seq（本實驗由云序提供），找到糖代謝的關鍵基因USP14，并發現USP14可增強肝糖原異生從而促進高 血糖癥。并且持續的內質網應激上調了USP14，從而增加了cAMP反應元件結合蛋白CBP的穩定性，從而增強了胰高 血糖素的作用和肝糖異生。肝臟中USP14的過表達顯 著增加了肝葡萄糖輸出。USP14的肝臟特異性敲除消除了內質網應激對葡萄糖代謝的影響，并且改善了肥胖小鼠的高 血糖癥和葡萄糖耐受不良。以上研究結果揭示了內質網應激導致葡萄糖穩態破壞的機制，并提出USP14可作為針對2型糖尿病的潛在治 療靶標。
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